[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于CRISPR技術(shù)定向遺傳改造米曲霉基因的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910911608.2
• 申請(qǐng)日: 2019-09-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110592073A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-12-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張哲;曾斌;龍傳南;范俊俠
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江西科技師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/10;C12N9/22;C12N15/63
• 代理公司: 36135 南昌大牛專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 喻莎

1.一種基于CRISPR技術(shù)定向遺傳改造米曲霉基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)以cas9序列為參考，人工合成cas9基因，其核苷酸序列為序列1所示的DNA分子；以上述人工合成的cas9基因?yàn)槟０澹孕蛄蠸EQ ID NO:1，SEQ ID NO:2的DNA片段為引物，執(zhí)行PCR擴(kuò)增獲得的cas9 DNA分子重組連接到載體pEX1上，所述重組載體為將pEX1的XhoI和BamHI識(shí)別序列間的DNA替換為序列1所示的DNA分子得到的重組載體pEX1-cas9，pEX1-cas9重組載體含有由構(gòu)巢曲霉基因gpdA基因啟動(dòng)子PgpdA，序列1所示的cas9基因，trpC基因終止子三部分組成的序列2所示的cas9蛋白表達(dá)盒，即PgpdA-cas9-TtrpC；

2)以上述cas9蛋白表達(dá)盒PgpdA-cas9-TtrpC為模板，以序列SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4的DNA片段為引物，執(zhí)行PCR擴(kuò)增獲得的cas9蛋白表達(dá)盒重組連接到載體pPTR II上。所述重組載體為在載體pPTR II的HindIII多克隆位點(diǎn)上插入PgpdA-cas9-TtrpC表達(dá)盒，得到重組載體pPTR II-cas9，其中載體pPTR II是一種可以在Aspergillus屬真菌內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制的穿梭載體；

3)以米曲霉RIB40基因組DNA為模板，以序列SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6的DNA片段為引物，執(zhí)行PCR擴(kuò)增獲得序列3所示的U6啟動(dòng)子U6 promoter融合靶基因的向?qū)蛄校渲蠸EQID NO:6的DNA片段含有靶基因的向?qū)蛄校瑥亩谠撊诤螪NA分子3’端融合了靶基因的向?qū)蛄校纬蒛6 promoter+guide sequence的融合DNA分子；以向?qū)NA和U6終止子序列為參考，人工合成sgRNA融合U6終止子，其核苷酸序列為序列4所示的DNA分子，并以此為模板，以SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8的DNA片段為引物，執(zhí)行PCR擴(kuò)增獲得序列4所示的sgRNA融合U6終止子，其中SEQ ID NO:7的DNA片段含有靶基因的向?qū)蛄校瑥亩谠撊诤螪NA分子5’端融合了靶基因的向?qū)蛄校纬蒰uide sequence+sgRNA+U6 terminator的融合DNA分子；以上述擴(kuò)增的U6promoter+guide sequence，guide sequence+sgRNA+U6 terminator融合DNA分子為模板，以SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:8的DNA片段為引物執(zhí)行重疊PCR擴(kuò)增，獲得的U6promoter+guide sequence+sgRNA+U6 terminator表達(dá)盒重組連接到載體pPTR II中，所述重組載體為在載體pPTR II的SmalI多克隆位點(diǎn)上插入U(xiǎn)6 promoter+guide sequence+sgRNA+U6 terminator表達(dá)盒，得到重組載體pPTR II-cas9-guide sequence；

4)米曲霉RIB40或3.042孢子接種到液體DPY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16-20h后收集菌絲，并用無(wú)菌水洗2次，用Yatalase酶法裂解上述菌絲，獲取原生質(zhì)體，將提取好的重組載體與原生質(zhì)體混勻，加上60％PEG 4000進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，室溫靜置20min后，離心收集原生質(zhì)體，并與含0.1μg/ml吡啶硫胺素，0.8％瓊脂的MM培養(yǎng)基混勻，平鋪在含0.1μg/ml吡啶硫胺素，1.5％瓊脂MM培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)3-4天；

5)挑取上述MM培養(yǎng)基長(zhǎng)出的菌絲，轉(zhuǎn)移至含0.1μg/ml吡啶硫胺素的CD培養(yǎng)基上，進(jìn)行二次篩選；

6)選取上述長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲的的CD平板，挑取菌絲，以SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10的DNA片段為引物執(zhí)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果看是否在靶基因向?qū)蛄猩习l(fā)生突變；

7)為獲得無(wú)標(biāo)記(Marker-Free)的陽(yáng)性菌株，將獲得的二輪篩選出的陽(yáng)性菌株在不含吡啶硫胺素的CD培養(yǎng)基上再連續(xù)培養(yǎng)四輪，挑取菌絲，以SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12的DNA片段為引物執(zhí)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)米曲霉是否還含有pPTR II-cas9載體，并再次對(duì)靶基因向?qū)蛄羞M(jìn)行測(cè)序。