[發(fā)明專利]檢測肺癌或腸癌中特異性T細胞分泌的細胞因子的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910910076.0
• 申請日: 2019-09-25
• 公開（公告）號: CN110646619A
• 公開（公告）日: 2020-01-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡振寨;俞耀軍;朱岳升;蘇小平;胡磊
• 申請（專利權(quán)）人: 格源致善(上海)生物科技有限公司;溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院;溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 50230 重慶市信立達專利代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 陳炳萍

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種檢測肺癌或腸癌中特異性T細胞分泌的細胞因子的方法，體系由檢測樣本、靶標、檢測樣本的刺激抗原和/或陽性對照抗原、檢測樣本的常規(guī)試劑組成。檢測體系中的樣本為肺癌或腸癌患者外周血分離后的單核細胞，然后經(jīng)多肽多輪刺激后檢測特異性T細胞分泌的細胞因子。本發(fā)明通過單核細胞誘導(dǎo)成DC細胞，然后將DC細胞與T細胞共培養(yǎng)，加多肽刺激三次后檢測特異性T細胞分泌的細胞因子，在不影響檢測靈敏度的情況下，從而達到縮短整個體系的檢測時間。本發(fā)明提供的檢測體系使用方法簡便，快速高效；能夠縮短檢測時間，提高檢測效率。本發(fā)明所提供的檢測體系的應(yīng)用范圍廣泛，具有巨大的市場價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測肺癌或腸癌中特異性T細胞分泌的細胞因子的方法。

背景技術(shù)

目前，最接近的現(xiàn)有技術(shù)：

細胞因子(cytokine，CK)是由免疫細胞(如單核、巨噬細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等)和某些非免疫細胞(內(nèi)皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等)經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、血細胞生成、細胞生長以及損傷組織修復(fù)等多種功能。細胞因子可被分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等。眾多細胞因子在體內(nèi)通過旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌等方式發(fā)揮作用，具有多效性、重疊性、拮抗性、協(xié)同性等多種生理特性，形成了十分復(fù)雜的細胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，參與人體多種重要的生理功能。

當機體感染疾病時，一系列相關(guān)細胞因子通過協(xié)調(diào)參與機體的免疫應(yīng)答過程。以結(jié)核免疫為例，結(jié)核分枝桿菌通過T淋巴細胞介導(dǎo)引起機體Ⅳ型超敏反應(yīng)，機體發(fā)揮T細胞免疫為主，多種細胞因子協(xié)同參與的免疫應(yīng)答，主要由CD4+T細胞即T輔助性1型細胞(Th1)和CD8+T細胞即T輔助性2型細胞(Th2)介導(dǎo)。相關(guān)細胞因子包括腫瘤壞死因子(TNF)、白介素-2(IL-2)、白介素-10(IL-10)、干擾素-γ(IFN-γ)等。

通過檢測記憶T細胞再次受特異性抗原刺激的反應(yīng)程度，通常表現(xiàn)為分泌各類細胞因子，可以揭示機體感染疾病的狀態(tài)，這是一種可靠的檢測方法，如γ干擾素釋放實驗，是在體外檢測T細胞經(jīng)結(jié)合特異性抗原刺激之后產(chǎn)生和釋放γ-干擾素能力的技術(shù)，借此判斷細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。刺激患者外周血單個核細胞使T淋巴細胞產(chǎn)生大量γ-干擾素，然后用酶聯(lián)免疫斑點法檢測γ-干擾素濃度。

利用抗原特異性T細胞的細胞免疫反應(yīng)進行病原微生物感染的體外診斷，是今年發(fā)展起來的一種新的檢測方法。通過分離新鮮全血中的外周血單核細胞并進行刺激培養(yǎng)，然后利用ELISPOT檢測能夠分泌IFN-γ的細胞的數(shù)量。該方法目前主要應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷。目前臨床普遍采用的結(jié)核診斷主要依賴于臨床癥狀、影響學(xué)診斷和病原學(xué)診斷，對結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染的診斷不敏感。同時，在結(jié)核病篩查過程中，直接檢測病原體或檢測結(jié)核分枝桿菌抗體的靈敏度和特異性也不理想。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：

(1)目前臨床普遍采用的結(jié)核診斷主要依賴于臨床癥狀、影響學(xué)診斷和病原學(xué)診斷，對結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染的診斷不敏感。

(2)在結(jié)核病篩查過程中，直接檢測病原體或檢測結(jié)核分枝桿菌抗體的靈敏度和特異性也不理想。

(3)體外檢測T細胞存在檢測時間過長的缺陷。

解決上述技術(shù)問題的難度：

(1)首先是關(guān)于樣本的采集量，如何做到用最少的樣本量，達到檢測目的。

(2)其次是如何縮短整個體系的檢測時間。

(3)最后如何在最少樣本量以及最短時間內(nèi)達到檢測靈敏度。

解決上述技術(shù)問題的意義：對于解決上述技術(shù)問題的意義在于，能夠?qū)崿F(xiàn)在更短時間內(nèi)，用最少量的樣本，達到檢測效果，從而提高檢測效率。