[發明專利]檢測肺癌或腸癌中特異性T細胞分泌的細胞因子的方法

在審

• 申請號: 201910910076.0
• 申請日: 2019-09-25
• 公開（公告）號: CN110646619A
• 公開（公告）日: 2020-01-03
• 發明（設計）人: 蔡振寨;俞耀軍;朱岳升;蘇小平;胡磊
• 申請（專利權）人: 格源致善(上海)生物科技有限公司;溫州醫科大學附屬第二醫院;溫州醫科大學附屬育英兒童醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 50230 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 陳炳萍

1.一種檢測肺癌或腸癌中特異性T細胞分泌的細胞因子的方法，其特征在于，所述檢測肺癌或腸癌中特異性T細胞分泌的細胞因子的方法包括以下步驟：

第一步，采集血液樣本到肝素抗凝采血管中，混勻；

第二步，血液樣本轉移到新的離心管中，并加入等體積的生理鹽水稀釋；

第三步，準備新的離心管中加入Ficoll-Histopaque分離液，將離心管傾斜至30°，然后將第二步中稀釋過后的血液樣本沿離心管加入到分離液中；

第四步，將第三步準備好的樣本在2500r/min下密度梯度離心30min，離心后分三層，吸出中間白色層到新的離心管中；加入生理鹽水稀釋，在1500r/min下離心10min，棄上清，加入生理鹽水稀釋，進行細胞計數；

第五步，將第四步中的細胞低速離心，在1200r/min下離心10min，棄上清，下層即為PBMC細胞；

第六步，用AIM-V無血清培養基將得到的PBMC細胞重懸，然后將PBMC細胞進行6孔板貼壁培養2小時后，將上層非貼壁細胞吸出加入新孔中繼續培養1小時；原孔中加入DC培養基和5％的血清進行培養；

第七步，培養1小時后，將上層細胞吸出加入到新的離心管中，1200r/min下離心10min后，計數后進行凍存；新孔中加入DC培養基和5％的血清繼續培養；

第八步，到第三天，對培養的細胞進行半量換液，并加入等量的培養因子；

第九步，到第五天，將凍存的非貼壁進行復蘇培養；根據所需要檢測的多肽數量進行鋪板，每孔細胞數為1x10⁵，培養24小時；

第十步，到第六天，誘導成為DC細胞，按照10:1的細胞數量，加入第九步復蘇的非貼壁細胞中，每孔加入相應的多肽刺激培養；

第十一步，每隔三天進行半量換液，并加入相應比例的培養因子和多肽；

第十二步，刺激三輪后，用Elispot檢測試劑盒進行細胞因子的含量。

2.一種如權利要求1所述檢測肺癌或腸癌中特異性T細胞分泌的細胞因子的方法的檢測肺癌或腸癌中特異性T細胞分泌的細胞因子的系統，其特征在于，所述檢測特異性T細胞的體系由檢測樣本、靶標、檢測樣本的刺激抗原和/或陽性對照抗原、檢測樣本的常規試劑組成；

所述檢測樣本為肝素抗凝的血液；樣本量是5mL、10mL、15mL、20mL、30mL或40mL；

所述刺激抗原為刺激記憶性T細胞的特異性抗原；

所述陽性對照抗原為刺激免疫細胞的非特異性刺激劑；

所述常規試劑指的是檢測細胞因子采用的常規檢測試劑。

3.如權利要求2所述的檢測肺癌或腸癌中特異性T細胞分泌的細胞因子的系統，其特征在于，所述檢測體系的靶標為細胞受刺激后分泌的物質。

4.如權利要求3所述的檢測肺癌或腸癌中特異性T細胞分泌的細胞因子的系統，其特征在于，所述的細胞受刺激后分泌的物質為細胞因子、趨化因子或蛋白中的任意一種或至少兩種的組合；

所述刺激記憶性T細胞的特異性抗原為天然蛋白、多肽、核酸、多糖、小分子化合物、病毒特異性抗原或細菌特異性抗原中的任意一種或至少兩種的組合。

5.如權利要求4所述的檢測肺癌或腸癌中特異性T細胞分泌的細胞因子的系統，其特征在于，細胞因子為免疫細胞和/或非免疫細胞受非特異性刺激劑刺激后分泌的細胞因子；

所述細胞因子具體為IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-17、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-β、SCF、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、神經白細胞素、IgA、IgG、穿孔素、顆粒素、IP10或TGF-β中的任意一種或至少兩種的組合；

所述天然蛋白、多肽、核酸、多糖、小分子化合物是能夠刺激細胞反應的過敏原。