[發明專利]一種基于COI基因序列的*和貝氏*的分子鑒別方法

在審

• 申請號: 201910907879.0
• 申請日: 2019-09-25
• 公開（公告）號: CN110616270A
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 李大命;張彤晴;唐晟凱;鐘立強;劉燕山;谷先坤;殷稼雯;蔣琦辰;劉小維
• 申請（專利權）人: 江蘇省淡水水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 32218 南京天華專利代理有限責任公司
• 代理人: 傅婷婷;瞿網蘭

本發明公開了一種基于COI基因序列的和貝氏的分子鑒別方法。該方法包含以下步驟：(1)分別提取和貝氏基因組DNA；(2)PCR擴增與貝氏的細胞色素氧化酶亞基I基因,(3)擴增產物純化后，直接測序，的COI基因擴增產物如SEQ ID NO.3所示,貝氏的COI基因擴增產物如SEQ ID NO.4所示；COI基因第18位點堿基是T的為貝氏，若該位點是C的為。該方法可以快速、簡便、準確、有效地鑒別與貝氏，結果穩定性好，重復率高，填補了目前國內分子生物學標準鑒別與貝氏的空白，也有利于開展與貝氏物種多樣性和遺傳多樣性研究。

技術領域

本發明屬于遺傳學領域，涉及一種基于COI基因序列的和貝氏的分子鑒別方法。

背景技術

(Hemiculter leucisculus)和貝氏(Hemiculter bleekeri)隸屬于鯉形目鲌亞科屬，是一類繁殖快、生活力強的小型魚類，可食用，具有一定的經濟價值。和貝氏在我國分布極廣，從南至北諸河流及湖泊均有，靜水、流水中都能生長、繁殖，數量較多，是魚類生態系統的重要組成部分，具有重要的生態價值，也是群體遺傳學研究的好材料。多年來，受過度捕撈、環境污染等不利因素的影響，和貝氏種群數量下降，遺傳多樣性水平降低。和貝氏生態位相近，形態和體色相似，在魚類調查中很難區分和鑒別。目前用于魚類物種鑒別的DNA序列有COI基因、Cytb基因、16S rRNA基因、微衛星等；但不同的物種適用的靶基因不同，即使靶基因相同，不同的靶區段依然會對結果產生顯著影響，有的靶區段包含特異性位點能夠用于物種鑒別，有的靶區段并不包含特異性位點，不能用于物種鑒別。

發明內容

本發明的目的是針對形態區分的困難，提供一種和貝氏的分子遺傳鑒別方法。

本發明的另一目的是提供一種用于和貝氏的分子遺傳鑒別的引物對。

本發明的又一目的是提供該引物對的應用。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

一種和貝氏的分子遺傳鑒別方法，包含以下步驟：

(1)分別提取待鑒定的和貝氏基因組DNA；

(2)以提取的基因組DNA為模板，PCR擴增與貝氏的細胞色素氧化酶亞基I基因,所述的上游引物為F：SEQ ID NO.1，下游引物為R：SEQ ID NO.2；

(3)擴增產物純化后，直接測序，的COI基因擴增產物如SEQ ID NO.3所示,貝氏的COI基因擴增產物如SEQ ID NO.4所示；COI基因第18位點堿基是T的為貝氏若該位點是C的為

作為本發明方法的優選，所述的PCR反應體系為50μL：80ng/μL的模板DNA 1μL，PCR緩沖液5μL，dNTP混合液4μL，每種dNTP 0.1mmol/L，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2μL2.5IU的Taq酶；雙蒸水36μL；所述的PCR緩沖液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/LKCl，30mmol/L MgCl₂，0.01％(g/100ml)明膠組成；PCR擴增反應程序為：94℃預變性3min，94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸60s，經30個循環后再72℃延伸10min。

一種用于與貝氏的分子遺傳鑒別的引物對，上游引物為F：SEQ ID NO.1，下游引物為R：SEQ ID NO.2。

本發明所述的引物對在分子遺傳鑒別與貝氏中的應用。

本發明所述的引物對在制備與貝氏分子遺傳鑒別試劑中的應用。

一種與貝氏分子遺傳鑒別試劑，包含本發明所述的引物對。