[發明專利]一種熒光定量RT-PCR試劑盒

在審

• 申請號: 201910906383.1
• 申請日: 2019-09-24
• 公開（公告）號: CN110643704A
• 公開（公告）日: 2020-01-03
• 發明（設計）人: 金潔;潘佳佳;王敬瀚;黃淑娟;黃建松;黃昕
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 33200 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 趙杭麗

本發明提供一種熒光定量RT?PCR試劑盒，包括對照品、分子標志物BCAT1反應液、內參基因甘油醛?3?磷酸脫氫酶反應液、TBgreen qPCR mix試劑。利用本發明提供的試劑盒，特異性好，靈敏度高，快速簡便、檢測結果可靠，能夠準確檢測人體中特異性針對急性髓系白血病分子標志物BCAT1的表達水平；且操作方法簡單，無需跑凝膠電泳，能為急性髓系白血病的預后分析及后續治療提供依據。敏感的試劑盒，對急性髓系白血病患者體內BCAT1基因表達水平進行檢測，敏感度、特異性均較高，本發明提供的試劑盒特異性好，靈敏度高，檢測方法簡答、易操作。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種熒光定量RT-PCR試劑盒，具體涉及一種特異性針對急性髓系白血病標志物BCAT1的引物對熒光定量RT-PCR試劑盒和檢測方法。

背景技術

急性髓系白血病由骨髓中異常的髓系原始細胞大量增殖并抑制正常造血導致，臨床上常表現為貧血、出血、感染、浸潤及高代謝的癥狀。近年來急性髓系白血病的發病率有增高的趨勢，化療、靶向藥物治療及造血干細胞移植是臨床上AML的主要治療手段。蒽環類及阿糖胞苷為基礎的誘導方案是AML化療的金標準，但是患者的完全緩解率僅維持在50％-70％左右，5年總體生存率僅20％-40％。AML患者在臨床表現及治療預后方面呈現極大的異質性。

目前國際通用的WHO AML的MICM(形態學、免疫學、細胞遺傳學及分子生物學)分型使白血病診斷從細胞形態學水平上升到分子生物學水平，對指導臨床治療和預后判斷具有實用價值。其中細胞遺傳學染色體核型異常是急性髓細胞性白血病(AML)中最重要的預后因素，根據細胞遺傳學分層可將AML分成低危組，中危組合高危組，其中有約50％的患者屬于正常核型AML(CN-AML，Cytogenetically normal Acute Myeloid Leukemia)，屬于預后中等組，這一部分患者存在明顯異質性，預后存在明顯差異，臨床決策中需要更為精細化的預后分層。

發明內容

本發明的目的在于提供一種熒光定量RT-PCR試劑盒，包括對照品、分子標志物支鏈氨基酸轉移酶1(BCAT1)反應液、內參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)反應液、TBgreenqPCR mix試劑，其中分子標志物BCAT1反應液由分子標志物BCAT1引物對和蒸餾水組成；內參基因GAPDH反應液由內參基因GAPDH引物對和蒸餾水組成。

所述分子標志物BCAT1引物對的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的內參基因GAPDH引物對的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。

所述對照品是急性髓系白血病細胞系THP-1的cDNA。

利用本試劑盒檢測急性髓系白血病患者BCAT1相對表達量的方法，包括以下步驟：

(1)取人體骨髓或外周血1.5-2ml，用EDTA抗凝，低溫冷藏備用；

(2)取血液標本在2h內用Trizol法及經典氯仿法抽屜單核細胞RNA，DEPC水溶解，-80℃保存；

(3)采用商用試劑盒對步驟2)獲得的樣本RNA進行逆轉錄反應，得到cDNA模板；

(4)將cDNA模板，BCAT1反應液及TBgreen qPCR mix混合后，組成反應體系，同時，cDNA模板、內參基因GAPDH反應液TBgreen qPCR mix混合后，組成該樣本的內參反應體系；采用熒光定量PCR法檢測樣本骨髓或外周血中分子標志物BCAT1的相對表達量。熒光定量PCR反應條件為：94℃預變性3min，94℃變性15s，60℃退火延伸1min，共45個循環。