[發(fā)明專利]一種人細小病毒和人博卡病毒雙重實時熒光PCR檢測引物、探針、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910905125.1
• 申請日: 2019-09-24
• 公開（公告）號: CN110628946A
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發(fā)明（設計）人: 楊海英;岳素文;馬寅佳;王雷;李英;張志強
• 申請（專利權(quán)）人: 北京卓誠惠生生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 11470 北京精金石知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 劉廣南

本發(fā)明屬于生物技術(shù)應用領(lǐng)域，具體涉及一種人細小病毒和人博卡病毒雙重實時熒光PCR檢測引物、探針、試劑盒及檢測方法，達到定量檢測、靈敏度高、特異性高以及預防假陰性的效果，為臨床樣本中人細小病毒B19V和人博卡病毒的快速定量檢測提供了完備的解決方案，能實現(xiàn)對人細小病毒B19V和人博卡病毒快速、準確的定量檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人細小病毒和人博卡病毒雙重實時熒光PCR檢測引物、探針、試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)

目前我國兒童中主要存在人細小病毒B19V及人博卡病毒HBoV感染，兩者均可通過呼吸道傳播且均為細小病毒中的一種。細小病毒是直徑約22nm的無包膜二十面體病毒，包含線性單鏈DNA基因組。細小病毒科(Parvoviridae)是已知的感染哺乳動物細胞的最小DNA病毒之一，被分為兩個亞科，細小病毒亞科(Parvovirinae)和濃核病毒亞科(Densovirinae)，分別感染脊椎和無脊椎動物細胞。目前根據(jù)脊椎動物病毒細小病毒亞科的開放讀碼框數(shù)量、轉(zhuǎn)錄定位、自主或在輔助病毒幫助下復制、序列同源性等因素分為原細小病毒(Protoparvovirus)、依賴性細小病毒(Erythoparvovirus)、博卡細小病毒(Bocaparvovirus)、埃文細小病毒(Aveparvovirus)、Copi細小病毒(Copiparvovirus)、細小病毒四(Tetraparvovirus)、阿留申病毒(Amdovirus)。

人細小病毒B19V細小病毒亞科紅系細小病毒屬，人群感染率達60％～70％以上。不同年齡和免疫狀態(tài)的人群感染B19V后的臨床表現(xiàn)不同。B19V是兒科常見的出疹性疾病——傳染性紅斑(又稱第五病，Erythema infection，EI)的病因；免疫力正常人群感染后一般為輕型自限性癥狀；孕婦感染可造成胎兒水腫和先天性貧血，嚴重時導致胎兒死亡；先天免疫缺陷患者、艾滋病患者、腫瘤或器官移植手術(shù)后進行化療的患者感染會導致慢性貧血癥；鐮狀細胞貧血癥等血液系統(tǒng)疾病患者感染會發(fā)生再生障礙性危象而導致急性貧血。此外，某些腎病、肝炎、神經(jīng)性疾病、心肌損傷和一些自身免疫疾病等病例也可能與B19V的感染有關(guān)。B19V可以被分為1、2、3三種基因型，其中1型和3型又各自分為兩種亞型。不同基因型毒株的地理分布不同：B19V1型在全球范圍占主導地位，B19V2型僅在丹麥、芬蘭和歐洲西北部等國家被發(fā)現(xiàn)，B19V病毒3型在法國、美國、巴西、加納、歐洲等地均有報道。

人博卡病毒(humanbocavirus，HBoV)發(fā)現(xiàn)于2005年，屬于細小病毒亞科的博卡病毒屬。當時確定為兒童下呼吸道感染病因而作為“病毒探索計劃”中的一部分，這種呼吸道病毒現(xiàn)在被分類為1型HBoV，隨后在糞便樣本中檢測到相關(guān)病毒：2型～4型HBoV。1型HBoV主要在呼吸道分泌物中發(fā)現(xiàn)，雖然在每個季節(jié)都可檢測到，但與其他呼吸道感染類似，原發(fā)感染主要發(fā)生于冬春兩季的月份。以1型HBoV為抗原的血清學研究發(fā)現(xiàn)，絕大部分人在6歲以前被感染過。1型HBoV主要經(jīng)呼吸道傳播，與呼吸道感染(特別是哮喘)相關(guān)。NS1基因相對較保守。HBoV與其它呼吸道病毒有較高的合并感染，HBoV單獨感染與合并其它呼吸道病毒感染在臨床特征方面無明顯差別。HBoV與牛細小病毒和犬極小病毒同屬細小病毒亞科中的博卡病毒屬，可引起兒童急性呼吸道感染。

《細小病毒B19與人博卡病毒的基因檢測及基因特異性探針的初步研究》(張學紅，第四軍醫(yī)大學碩士學位論文，2009年5月)中公開了一種檢測B19和HBoV的基因芯片技術(shù)，是一種快速、敏感、高通量、高效的臨床診斷方法。由于芯片制作的工藝復雜,信號檢測也需要專門的儀器設備，一般實驗室難以承擔其高昂的費用；需采用來自大小相近的多個基因芯片片段作為探針來檢測同一分子以顯著提高信噪比，增加雜交動力學范圍,顯著降低假陽性率；可以特異性的檢測出不同的細小病毒變種，但對B19樣本的呼吸道標本中病毒的檢出率較低，HBoV混合感染其他病毒的樣本中也未檢出HBoV。