[發明專利]一種異淀粉酶的基因工程菌及其應用

在審

• 申請號: 201910903125.8
• 申請日: 2019-09-24
• 公開（公告）號: CN112625984A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 崔樹梅;史魯秋;薛虹宇;汪昌國;蘇桂珍;其他發明人請求不公開姓名
• 申請（專利權）人: 南京盛德生物科技研究院有限公司;南京美榮生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P19/18;C12P19/16;C12P19/04;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇舜點律師事務所 32319
• 代理人: 孫丹

本發明公開了一種異淀粉酶的基因工程菌及其應用，屬于基因工程技術領域。本發明以E.coli BW25113為宿主菌，構建了異淀粉酶的基因工程菌E.coli BW25113(A0A147KK56/pBAD HisB）。本發明基因工程菌表達異淀粉酶蛋白活性高，其酶活可達3936 U/g，生產成本低。本發明基因工程菌能夠廣泛應用于α?環糊精工業生產。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，更具體地說，它涉及一種異淀粉酶的基因工程菌及其在合成α-環糊精中的應用。

背景技術

異淀粉酶是淀粉酶家族的重要成員，屬于淀粉脫支酶的一種。異淀粉酶是一種內切型淀粉酶，能專一性地切開支鏈淀粉分支點的α-1，6-糖苷鍵，可以剪下整個側支，形成直鏈淀粉，且不能水解直鏈分子中的α-1，6-糖苷鍵。由于異淀粉酶對底物中α-1，6-糖苷鍵位置的特異性強，因而被廣泛應用于酶制劑或食品加工業的加工助劑。異淀粉酶單獨使用可使支鏈淀粉變為直鏈淀粉，也可與糖化酶、β-淀粉酶、環糊精葡萄糖基轉移酶、4-α-葡聚糖轉移酶等淀粉酶配合使用生產葡萄糖、麥芽糖、環糊精、抗性淀粉等產品，縮短反應時間，提高淀粉的轉化率，降低其他糖化酶制劑的使用量，從而達到增加產量、提高設備利用率、降低生產成本的目的。目前雖然國內在異淀粉酶研究上有相關報道，但現在市場上的商業化產品仍主要為進口酶制劑。目前仍急需研究可以商業化應用的異淀粉酶來擴大異淀粉酶庫。

現有技術有報道異淀粉酶TfIA，來源于嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca），其具有較高活性的酶，在大腸桿菌中能夠實現重組表達。源于Thermobifida cellulosilyticaTB100菌的異淀粉酶基因A0A147KK56在核苷酸水平上與TfIA同源性高于85%，其表達的蛋白與TfIA具有相當的異淀粉酶活性。目前，A0A147KK56在大腸桿菌中的重組表達還未見報道。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種異淀粉酶的基因工程菌，所述基因工程菌是以E.coli BW25113（購自Biovector NTCC INC，貨號為355297）為宿主菌，表達異淀粉酶基因A0A147KK56，異淀粉酶A0A147KK56的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因工程菌的具體構建方法是：將異淀粉酶基因A0A147KK56連接到表達載體pBAD HisB（購自Invitrogen公司，產品目錄號V430-01）上，得到合成質粒A0A147KK56/pBAD HisB；將合成質粒A0A147KK56/pBAD HisB轉化到大腸桿菌E.coli BW25113宿主菌中，得到基因工程菌E.coliBW25113(A0A147KK56/pBAD HisB）。

所述合成質粒A0A147KK56/pBAD HisB轉化到大腸桿菌E.coli BW25113宿主菌的具體步驟為：

(1)取一支儲存于-80℃含有50~200 μL的E.coli BW25113感受態細胞在冰上解凍20~30 min；

(2)在合成質粒固體粉末中加入40 μL的ddH₂O，充分混勻；

(3)取2~3 μL的步驟（2）合成質粒溶液加入步驟（1）解凍后的感受態細胞中，加入過程中用手指輕輕撥彈；

(4)將步驟（3）產物在冰上放置20~30 min，再將其放置在42℃水浴鍋中水浴120 s進行熱擊，熱擊完成后立即取出放回冰上靜置2~5 min；

(5)加入800 μL的2YT液體培養基，并在振蕩頻率為200 rpm的37℃振蕩培養箱培養40min；

(6)取步驟（5）的轉化菌液50 μL涂布于2YT固體培養基平板上，于37℃培養10~12 h；

(7)挑選單菌落至含100 μg/mL氨芐青霉素的抗性液體2YT培養基中，于37℃培養6~8h；

(8)取等體積菌液與等體積無菌80%（體積）甘油溶液混合放置于保菌管，儲存于-80℃冰箱，備用。

所述異淀粉酶的基因工程菌誘導產酶的具體方法如下：