[發(fā)明專利]一種異淀粉酶的基因工程菌及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910903125.8
• 申請日: 2019-09-24
• 公開（公告）號: CN112625984A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔樹梅;史魯秋;薛虹宇;汪昌國;蘇桂珍;其他發(fā)明人請求不公開姓名
• 申請（專利權(quán)）人: 南京盛德生物科技研究院有限公司;南京美榮生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P19/18;C12P19/16;C12P19/04;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇舜點律師事務(wù)所 32319
• 代理人: 孫丹

1.一種異淀粉酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以E.coli BW25113為宿主菌，表達(dá)異淀粉酶基因A0A147KK56，所述異淀粉酶基因A0A147KK56的核苷酸序列如SEQNo.1所示，所述基因工程菌構(gòu)建方法為：將異淀粉酶基因A0A147KK56連接到表達(dá)載體pBADHisB上，得到合成質(zhì)粒A0A147KK56/pBAD HisB；將合成質(zhì)粒A0A147KK56/pBAD HisB轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BW25113宿主菌中，得到基因工程菌E.coli BW25113(A0A147KK56/pBADHisB）。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異淀粉酶的基因工程菌，其特征在于所述合成質(zhì)粒A0A147KK56/pBAD HisB轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BW25113宿主菌的具體步驟為：

（1）取一支儲存于-80℃含有50~200 μL的E.coli BW25113感受態(tài)細(xì)胞在冰上解凍20~30 min；

（2）在合成質(zhì)粒固體粉末中加入40 μL的ddH₂O，充分混勻；

（3）取2~3 μL的步驟（2）合成質(zhì)粒溶液加入步驟（1）解凍后的感受態(tài)細(xì)胞中，加入過程中用手指輕輕撥彈；

（4）將步驟（3）產(chǎn)物在冰上放置20~30 min，再將其放置在42℃水浴鍋中水浴120 s進(jìn)行熱擊，熱擊完成后立即取出放回冰上靜置2~5 min；

（5）加入800 μL的2YT液體培養(yǎng)基，并在振蕩頻率為200 rpm的37℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)40min；

（6） 取步驟（5）的轉(zhuǎn)化菌液50 μL涂布于2YT固體培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)10~12 h；

（7）挑選單菌落至含100 μg/mL氨芐青霉素的抗性液體2YT培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)6~8h；

（8）取等體積菌液與等體積無菌80%（體積）甘油溶液混合放置于保菌管，儲存于-80℃冰箱，備用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的異淀粉酶的基因工程菌，其特征在于，所述異淀粉酶的基因工程菌誘導(dǎo)產(chǎn)酶的具體方法如下：

（1）將-80℃保存的基因工程菌E.coli BW25113(A0A147KK56/pBAD HisB）在2YT固體培養(yǎng)基平板上劃線分離，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，得到單克隆菌落；

（2）挑取單克隆菌落接種至2YT液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)4~6 h，后將所得培養(yǎng)液按1%~2%的接種量接種至搖瓶中，于37℃，200 rpm培養(yǎng)2~3 h后；

（3）用最終濃度為1%~2%（質(zhì)量）的阿拉伯糖誘導(dǎo)產(chǎn)酶，誘導(dǎo)溫度為25℃~30℃，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為220 rpm，誘導(dǎo)時間為14~18 h。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的異淀粉酶的基因工程菌，其特征在于，所述2YT固體培養(yǎng)基成分為分子級蛋白胨9~11 g/L，分子級酵母粉4~6 g/L，NaCl 4~6 g/L，瓊脂粉1.5%~2%（質(zhì)量），氨芐青霉素100 μg/mL，pH為6.8~7.2。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的異淀粉酶的基因工程菌，其特征在于，所述2YT液體培養(yǎng)基成分為分子級蛋白胨9~11 g/L，分子級酵母粉4~6 g/L，NaCl 4~6 g/L，pH為6.8~7.2。

6.根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項所述的異淀粉酶的基因工程菌在合成α-環(huán)糊精中的應(yīng)用。