[發明專利]過表達ATF基因的生產乙酸丁酯的拜氏梭菌

有效

• 申請號: 201910898097.5
• 申請日: 2019-09-23
• 公開（公告）號: CN112538451B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 金明杰;方大徽;聞志強;翟睿;許召賢
• 申請（專利權）人: 南京理工大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/54;C12N15/74;C12P7/62;C12R1/145
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 劉海霞

本發明公開了一株過表達ATF基因的生產乙酸丁酯的拜氏梭菌。本發明以高效生產丁醇和乙酰?CoA的拜氏梭菌作為宿主，引入醇酰基轉移酶基因，獲得過表達ATF基因的拜氏梭菌基因工程菌。本發明的基因工程菌株可在72h內生產1.5g/L乙酸丁酯，通過在發酵培養基中添加10％十二烷和1％碳酸鈣，可進一步提高乙酸丁酯的產量至5.5g/L，拜氏梭菌適用于工業化發酵生產乙酸丁酯。

技術領域

本發明涉及一株過表達ATF基因的生產乙酸丁酯的拜氏梭菌，屬于基因工程菌技術領域。

背景技術

乙酸丁酯是一種常用的化工原料，常作為涂料的溶劑和稀釋劑被用于印刷、固化劑等加工過程中，同時，也被廣泛用作人造革、紡織品和塑料生產中的溶劑和萃取劑，而且乙酸丁酯還是重要的藥物中間體[Matsuyama A,Yamamoto H,Kobayashi Y.PracticalApplication of Recombinant Whole-Cell Biocatalysts for the Manufacturing ofPharmaceutical Intermediates Such as Chiral Alcohols[J].Organic ProcessResearchDevelopment,2002,6(4):558-561.]。傳統的乙酸丁酯的生產方式是在110℃以上的高溫條件下通過乙酸和正丁醇酯化反應合成，該方法存在工藝時間長、反應能耗大以及副反應等問題，且最終產品后續分離還比較困難。并且，乙酸丁酯的合成過程中因需持續在高溫條件下進行，耗能高且存在安全隱患[伍小明.我國乙酸丁酯合成技術研究進展[J].精細與專用化學品,2018,v.26(08):55-57.]。

梭菌屬通常是革蘭氏陽性厭氧細菌，梭菌的細胞帶有纖毛以便其移動并且能夠形成內生孢子，通常在自然界中發現，其主要棲息地是土壤、河流污泥、活性污泥、動物排泄物等。其中拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)以其明顯的底物耐受性的能力，以及其潛在代謝產物的多樣化而著稱，是一株優良的產溶劑梭菌，其在溶劑產量和生產率上均非常優秀[Lee S Y,Park J H,Jang S H,et al.Fermentative butanol production byclostridia[J].Biotechnology and bioengineering,2008,101(2):209-228.]。

編碼醇乙酰轉移酶(AATase)的ATF1基因[Fujii T,Nagasawa N,Iwamatsu A,etal.Molecular cloning,sequence analysis,and expression of the yeast alcoholacetyltransferase gene[J].Applied and Environmental Microbiology,1994,60(8):2786-2792.]是來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和啤酒酵母(Saccharomycesuvarum)。釀酒酵母來源的ATF1基因的核苷酸序列由1575bp的開放閱讀框組成，其編碼525個氨基酸。盡管酵母AAT酶被認為是膜結合酶，但疏水性分析的結果表明該基因產物不具有顯著疏水的跨膜區域。使用ATF1基因作為探針的酵母基因組的Southern分析顯示釀酒酵母具有一個ATF1基因，而啤酒釀造酵母具有一個ATF1基因和另一個同源基因(Lg-ATF1)。

發明內容

本發明的目的在于提供一株過表達ATF基因的生產乙酸丁酯的拜氏梭菌。本發明將ATF1基因導入到拜氏梭菌中，構建新的工程菌株。該工程菌株表達ATF1基因的醇酰基轉移酶，在該酶的作用下，工程菌株在葡萄糖培養基中發酵后成功獲得目標產物乙酸丁酯。

實現本發明目的的技術方案如下：

過表達ATF基因的生產乙酸丁酯的拜氏梭菌，通過在拜氏梭菌基因組中插入醇酰基轉移酶基因(ATF1基因)構建而成。

本發明提供上述過表達ATF基因的生產乙酸丁酯的拜氏梭菌的構建方法，具體步驟如下：