[發明專利]一種誘導汗腺功能性修復的方法

在審

• 申請號: 201910895337.6
• 申請日: 2019-09-20
• 公開（公告）號: CN110684802A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 孫曉艷;陳潤開;付小兵;黃瑾
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/90;C12N15/12;C12N5/10
• 代理公司: 11319 北京潤澤恒知識產權代理有限公司
• 代理人: 莎日娜

本發明提供了一種誘導汗腺功能性修復的方法，包括：設計EDA啟動子序列，構建pGLV?H1?GFP?EDA sgRNA質粒；獲取pHAGE?TRE?dCas9?VP64質粒；利用慢病毒分別對上述兩種質粒進行包裝；利用上述兩種慢病毒包裝的質粒依次轉染獲取的基底層表皮角質細胞，獲得穩定過表達EDA基因的細胞株；利用含強力霉素的培養基培養細胞株為汗腺樣細胞；在基質膠環境下，利用含強力霉素的培養基培養汗腺樣細胞形成類汗腺原基；將類汗腺原基移植至汗腺喪失區，利用強力霉素誘導形成再生汗腺。本發明應用CRISPR/dCas9技術在基因水平上對基底層表皮角質細胞進行編輯修飾，提高了汗腺重編程的效率；同時以基質膠為支架聯合汗腺特異性培養基，誘導表皮角質細胞形成類汗腺原基，促進了體內汗腺從組織結構到生理功能的修復。

技術領域

本發明涉及汗腺再生研究領域，特別是涉及一種誘導汗腺功能性修復的方法。

背景技術

汗腺作為皮膚的重要附屬器官，在物質代謝、體溫調節以及維持機體內環境穩態等方面都具有舉足輕重的作用。嚴重燒/創傷引起的大面積體表皮膚軟組織缺損，其后期主要表現為增生性瘢痕修復，失去皮膚的正常組織學結構及生理功能。特別是大量瘢痕組織的形成導致汗腺結構被破壞且無法再生，機體由此失去了通過排汗來調控體溫這一基本功能，這不僅給患者的生理與心理帶來巨大的負擔，而且嚴重影響了患者的生活質量。因此，汗腺再生的研究具有十分顯著的現實意義和社會意義。

近年來，基因編輯技術發展十分迅速，在眾多的基因編輯技術中，以CRISPR/dCas9技術為代表的第三代基因編輯技術由于其具有安全性好、效率高、可以精準定位、操作簡便易行等優點，被認為是針對人類體細胞進行基因編輯的有效手段之一。EDA基因屬于腫瘤壞死因子家族，其在皮膚附屬器(尤其是汗腺)形成中起重要作用。EDA主要通過EDA受體激活核因子-κB調節汗腺成熟。因此，重編程汗腺細胞過程中，EDA基因可作為一個潛在的干預靶點。基質膠是一種具有生物學活性的三維培養基質，能夠為細胞提供保護和支撐，使其在立體環境中增殖。相較于傳統的二維培養體系，基質膠所提供的立體構架更接近于正常組織的三維空間基質環境，使得細胞在體外增殖、分化過程中形成的類器官體(organoid)在形態上接近其來源組織，更符合機體組織器官的發生、發展過程。

研究表明，位于基底層的表皮角質細胞(Human Epidermal Keratinocytes,HEK)具有干細胞的特征。這些細胞不但表達干細胞的表面標記，如β1和α6integrin、CK19、CK15及Sox9等，還可以通過不對稱分裂完成自我更新，直接參與并影響創面的修復進程。而且有學者指出，表皮基底層角質細胞較其他組織來源的體細胞在發育進程上更為原始，具有強大的可塑性。它們一方面通過調節自我更新與分化之間的平衡來維持表皮組織的結構完整，另一方面通過轉分化形成皮膚內其他譜系來源的細胞類型，參與皮膚的重建與再生。結合表皮與汗腺在發育上的同源性，毋容置疑，表皮基底層角質細胞可以作為修復種子細胞之一，用于汗腺再生相關的基礎與臨床研究。

但是，傳統的誘導表皮角質細胞轉分化為汗腺的技術體系有重編程效率低、轉化細胞適應能力差，以及形成的組織替代物無功能等局限性。

發明內容

鑒于上述問題，提出了本發明實施例以便提供一種克服上述問題或者至少部分地解決上述問題的一種誘導汗腺功能性修復的方法。

為了解決上述問題，本發明實施例公開了一種誘導汗腺功能性修復的方法，其中，包括以下步驟：

設計EDA啟動子序列，構建pGLV-H1-GFP-EDA sgRNA質粒；

獲取pHAGE TRE dCas9-VP64質粒；

利用慢病毒分別對pGLV-H1-GFP-EDA sgRNA質粒和pHAGE-TRE-dCas9-VP64質粒進行包裝；

獲取基底層表皮角質細胞；