[發明專利]一種誘導汗腺功能性修復的方法

在審

• 申請號: 201910895337.6
• 申請日: 2019-09-20
• 公開（公告）號: CN110684802A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 孫曉艷;陳潤開;付小兵;黃瑾
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/90;C12N15/12;C12N5/10
• 代理公司: 11319 北京潤澤恒知識產權代理有限公司
• 代理人: 莎日娜

1.一種誘導汗腺功能性修復的方法，其特征在于，包括以下步驟：

設計EDA啟動子序列，構建pGLV-H1-GFP-EDA sgRNA質粒；

獲取pHAGE TRE dCas9-VP64質粒；

利用慢病毒分別對pGLV-H1-GFP-EDA sgRNA質粒和pHAGE TRE dCas9-VP64質粒進行包裝；

獲取基底層表皮角質細胞；

利用慢病毒包裝的pGLV-H1-GFP-EDA sgRNA質粒及慢病毒包裝的pHAGE-TRE-dCas9-VP64質粒依次轉染所述表皮角質細胞，并進行EDA基因鑒定，獲得穩定過表達EDA基因的細胞株；

利用具有強力霉素的汗腺培養基培養所述細胞株，誘導其體外重編程為汗腺樣細胞；

在基質膠環境下，利用具有強力霉素的汗腺培養基培養所述汗腺樣細胞，誘導形成類汗腺原基；

將所述類汗腺原基移植至汗腺喪失區，并利用強力霉素誘導形成再生汗腺。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述啟動子序列為：

F-5′-ACCCGTTCCTGCGCGACAG-3′，

R-5′-TCATTCCCTCGGCGGGCCGA-3′。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有強力霉素的培養基，包括DMEM/F12、Gltamax、Hepes、B27、EGF和bFGF。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述Gltamax、Hepes和B27的體積分數均為1％，EGF的濃度為50ng/mL，bFGF的濃度為20ng/mL。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述在基質膠環境下，利用具有強力霉素的培養基，包括：

將濃度為10mg/mL下基質膠與密度為2.5×10⁵/mL的汗腺樣細胞懸液等體積混勻后鋪板，待基質膠凝固后加入含強力霉素的汗腺培養基進行培養，得到類汗腺原基。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述汗腺培養基中強力霉素的濃度為10ug/mL。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用慢病毒包裝的pGLV-H1-GFP-EDAsgRNA質粒及慢病毒包裝的pHAGE-TRE-dCas9-VP64質粒依次轉染所述表皮角質細胞，并進行EDA基因鑒定，獲得穩定過表達EDA基因的細胞株，包括：

利用聚凝胺對所述表皮角質細胞進行預處理；

采用Lipo2000作為轉染試劑，利用pMD2G和PsPAX作為包裝載體，將pGLV-H1-GFP-EDAsgRNA質粒與包裝載體混合后，轉入人腎上皮細胞系239T細胞中進行第一次病毒包裝，收集第一次包裝后的病毒液，將病毒液轉入預處理后的表皮角質細胞中進行第一次轉染，將第一次轉染后的表皮角質細胞換液至含HKGS的EpiLife培養基中進行傳代培養，后通過細胞流式分選，獲得GFP表達強陽性的細胞亞群；

利用聚凝胺對所述GFP表達強陽性的細胞亞群進行預處理；

采用Lipo2000作為轉染試劑，利用pMD2G和PsPAX作為包裝載體，將pHAGE-TRE-dCas9-VP64質粒與包裝載體混合后，轉入人腎上皮細胞系293T細胞中進行第二次病毒包裝，然后收集第二次包裝后的病毒液，將病毒液轉入所述GFP表達強陽性的細胞亞群進行第二轉染；并通過抗生素G418進行陽性細胞篩選；

將G418篩選陽性的細胞亞群進行EDA基因鑒定，獲得穩定過表達EDA基因的細胞株。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述預處理后的表皮角質細胞的細胞融合度為40％，所述預處理后的GFP表達強陽性的細胞亞群的細胞融合度為40％。

9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述包裝載體中，pMD2G和PsPAX的質量比為1：3。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述獲取基底層表皮角質細胞，包括：

取新鮮包皮組織，利用醫用酒精進行消毒，將消毒后的包皮組織除去皮下部分，并用含有10％青霉素/鏈霉素混合液的PBS反復沖洗，隨后剪成1cm×1cm×2mm大小組織塊，加入0.2％dispase II溶液，浸沒組織，4℃消化過夜，再將表皮層與真皮層分離，剪碎，加入0.25％的胰蛋白酶/EDTA，37℃消化10min，加入含10％胎牛血清的DMEM終止消化，100目濾網過濾細胞懸液，收集濾過的細胞懸液于離心管中，1000rmp，離心5min，棄去上清液，加入含1％HKGS的EpiLife培養基重懸細胞，在37℃、5％CO2的環境下進行孵育過夜，再更換培養基進行傳代培養，即得到基底層表皮角質細胞。