[發(fā)明專利]一種檢測尿嘧啶糖基化酶的化學發(fā)光生物傳感器及其制備方法與應用

有效

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• 申請日: 2019-09-20
• 公開（公告）號: CN110607351B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發(fā)明（設計）人: 王玉;張雪;劉素;黃加棟;宋曉蕾;李莎莎;王敬鋒;王海旺;孫文玉;王業(yè)茹
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;G01N21/76
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

本發(fā)明涉及生物傳感器技術領域，特別涉及基于三通路結構驅動鏈置換反應及DNA walker技術驅動球形核酸酶的化學發(fā)光技術檢測尿嘧啶糖基化酶。為了解決以上現有技術中檢測尿嘧啶糖基化酶的方法存在操作復雜、靈敏度比較低、成本高的問題，一種基于三通路結構和DNA walker兩種納米技術的生物傳感器利用球形核酸酶催化魯米諾發(fā)生化學發(fā)光反應進行檢測。制備方法：納米金的制備；球形核酸的制備；均相中形成球形核酸酶用于催化魯米諾的化學發(fā)光反應。利用了尿嘧啶糖基化酶對U堿基的特異性識別和切除，實現目標的特異性檢測；同時采用DNA walker納米技術實現目標的快速、高靈敏性檢測。

技術領域

本發(fā)明涉及生物傳感器技術領域，特別涉及基于三通路結構和DNA walker納米技術檢測尿嘧啶糖基化酶的化學發(fā)光生物傳感器及其制備方法，還涉及球形核酸酶技術。

背景技術

DNA的完整性對于維持生物體的功能是至關重要的，當DNA出現自發(fā)性損傷時，會啟動堿基切除修復機制（BER）進行DNA損傷的修復。BER修復途徑主要是由DNA糖基化酶啟動的，其中，尿嘧啶糖基化酶（UDG）是通過特異性識別并且去除DNA中胞嘧啶脫氨形成的尿嘧啶U，形成AP位點，在無嘌呤/嘧啶核酸內切酶1（APE1）或者內切酶IV（Endo IV）的作用下切割DNA鏈，產生鏈的斷裂，通過后續(xù)DNA聚合酶和連接酶的共同作用完成DNA鏈的修復。尿嘧啶糖基化酶在維持基因的完整性方面起到了非常重要的作用，此外，該酶的異常表達與各種疾病的發(fā)生相關，包括免疫缺陷病、神經退行性疾病及癌癥等。因此，尿嘧啶糖基化酶的早期檢測對于一些生物過程的研究及疾病的早期診斷起到了重要的作用。

目前報道的尿嘧啶糖基化酶檢測技術有酶聯(lián)免疫法、比色法、凝膠電泳耦合放射性標記的方法等，這些方法中有些存在抗體的功能化和抗體酶標記等過程，導致檢測過程非常復雜，此外，還存在成本高、檢測靈敏度差以及重現差等問題。因此，目前需要構建一種高靈敏性、操作簡單、高效、可靠的平臺用于尿嘧啶糖基化酶的檢測。

發(fā)明內容

針對目前缺乏一種高效、靈敏便捷的檢測尿嘧啶糖基化酶的方法的問題，本發(fā)明提供一種基于三通路結構驅動鏈置換反應及DNA walker技術驅動球形核酸酶的化學發(fā)光技術檢測尿嘧啶糖基化酶，主要是包括構建三通路結構和球形核酸兩種納米結構，利用尿嘧啶糖基化酶對U堿基的特異性識別和切除，在內切酶IV的輔助下，實現三通路結構的變化和DNA walking反應的驅動，從而形成球形核酸酶用于催化魯米諾發(fā)生反應產生化學發(fā)光信號，顯著提高了檢測的靈敏度和檢測速度，更有利于尿嘧啶糖基化酶在實際樣本中的檢測。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

本發(fā)明中一共用到了5條DNA鏈，其序列分別是：

UP：AGT CAG TAT GCA CUC GTG TTA AGC GTG SA：TCT TTC GGC CGC GTT CAC GAGTGC ATC CGC GCT TGG G(T)₅₀G CTC GCC CAA GCG CGG BS：TTTCAC GCT TCG CGG CCG AAA GAT TT linker：SH-(T)₁₀CA AGC GCG GAT GCA C G-HP：SH-(T)₁₀GG GTA GGG CGG GTT GGG XGA GCT TTT CCC TAC。