[發(fā)明專利]一種循環(huán)miR-1290的檢測方法

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• 申請日: 2019-09-18
• 公開（公告）號: CN110656162A
• 公開（公告）日: 2020-01-07
• 發(fā)明（設計）人: 蔡建庭;徐麗怡;朱永良;陳肖
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6886
• 代理公司: 11411 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 陳劍聰

1.一種循環(huán)miR-1290的檢測方法，其特征在于，包含以下步驟：

(1)從檢測樣本血漿或血清中提取循環(huán)miRNA；

(2)莖環(huán)法逆轉錄：將步驟(1)中得到的miRNA進行特異性莖環(huán)法逆轉錄；

(3)qPCR檢測：以步驟(2)中所獲得的cDNA為模板，進行qPCR檢測。

2.根據(jù)權利要求1所述的循環(huán)miR-1290的檢測方法，其特征在于，步驟(1)中，提取循環(huán)miRNA是通過核酸吸附柱來實現(xiàn)的。

3.根據(jù)權利要求1所述的循環(huán)miR-1290的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中，逆轉錄體系包括逆轉錄緩沖液、逆轉錄酶、逆轉錄引物、無核酸酶純水和miRNA模板；逆轉錄引物含有用于精確區(qū)分高度同源的miRNA的特異性莖環(huán)結構；針對所述miR-1290的逆轉錄引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；逆轉錄的反應條件為：16℃溫浴30min，37℃溫浴30min，85℃加熱5min使酶失活，4℃保存。

4.根據(jù)權利要求3所述的循環(huán)miR-1290的檢測方法，其特征在于，逆轉錄體系總體積為20μL，其中，逆轉錄緩沖液10μL、逆轉錄酶1.5μL、逆轉錄引物1μL、無核酸酶純水稀釋的miRNA模板7.5μL。

5.根據(jù)權利要求1所述的循環(huán)miR-1290的檢測方法，其特征在于，步驟(3)中，qPCR檢測的反應體系包括：Taqman預混液、特異性正向引物、通用反向引物、Taqman探針，無核酸酶純水和cDNA模板；針對所述miR-1290的特異性正向引物、Taqman探針和通用反向引物的核苷酸序列分別如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.10所示；qPCR檢測的反應條件為：95℃預變性2.5min，95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

6.根據(jù)權利要求5所述的循環(huán)miR-1290的檢測方法，其特征在于，qPCR檢測的反應體系總體積為10μL，其中，Taqman預混液5μL、特異性正向引物(10mM)0.2μL、通用反向引物(10mM)0.2μL、Taqman探針(10mM)0.4μL，無核酸酶純水稀釋的cDNA模板4.2μL。

7.根據(jù)權利要求1所述的循環(huán)miR-1290的檢測方法，其特征在于，步驟(1)中，添加內(nèi)參體系，內(nèi)參體系包含：內(nèi)參miR-16-5p和cel-miR-39以及相應的逆轉錄引物、qPCR正向引物和Taqman探針，

miR-16-5p的逆轉錄引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4，

miR-16-5p的qPCR正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，

miR-16-5p的Taqman探針的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，

cel-miR-39的逆轉錄引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，

cel-miR-39的qPCR正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，

cel-miR-39的Taqman探針的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；

miR-16-5p的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

cel-miR-39的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。

8.根據(jù)權利要求7所述的循環(huán)miR-1290的檢測方法，其特征在于，所述內(nèi)參cel-miR-39是在樣本提取過程中加入的體積為2μL的內(nèi)參cel-miR-39溶液，濃度為0.2uM。

9.一種試劑盒，其特征在于，其是用權利要求1-8任一所述的循環(huán)miR-1290的檢測方法制備成miR-1290分析試劑盒。

10.一種應用，其特征在于，其是用權利要求1-8任一所述的循環(huán)miR-1290的檢測方法，進行血清或血漿樣本的miR-1290表達水平檢測，以用于基礎研究和臨床應用。