[發(fā)明專利]一種循環(huán)miR-1290的檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910878912.1
• 申請日: 2019-09-18
• 公開（公告）號: CN110656162A
• 公開（公告）日: 2020-01-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡建庭;徐麗怡;朱永良;陳肖
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6886
• 代理公司: 11411 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 陳劍聰

本發(fā)明公開了一種循環(huán)miR?1290的檢測方法，包含以下步驟：(1)從檢測樣本血漿或血清中提取循環(huán)miRNA；(2)莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄：將步驟(1)中得到的miRNA進行特異性莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄；(3)qPCR檢測：以步驟(2)中所獲得的cDNA為模板，進行qPCR檢測。本發(fā)明成本相對較低，而靈敏度和特異性較好。可用于人和動物等相關(guān)的基礎(chǔ)和應用研究工作。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域，具體涉及一種循環(huán)miR-1290的檢測方法。

背景技術(shù)

MicroRNA(miRNA)是一類長約19-23個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，是一類重要的調(diào)控因子。miRNA通過與靶mRNA的互補配對，降解靶mRNA或抑制翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因表達進行調(diào)控。miRNA具有高度保守性和嚴格的時空特異性，與其靶mRNA分子組成了復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，參與包括細胞增殖、凋亡、細胞分化、發(fā)育和逆境應答等多種生命活動。miRNA在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。

研究表明，miRNA可以穩(wěn)定地存在于血清和血漿等多種體液中，這種miRNA被稱為循環(huán)miRNA，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為腫瘤篩查、高風險人群預測及治療效果評估的重要標志物。循環(huán)miRNA主要來源于兩種途徑：組織損傷或凋亡壞死細胞的被動滲漏和源自細胞的微囊泡的主動分泌。循環(huán)miRNA雖獨立于細胞而存在，但是具有較高的穩(wěn)定性，可能是由于RNA與DNA退火，從而既能耐受DNase又能耐受RNase降解，或者RNA被包入脂質(zhì)或脂蛋白復合物內(nèi)而收到保護，或者通過化學修飾或與蛋白結(jié)合而受到保護。

目前miRNA的檢測方法主要有Northern blot分析、實時熒光定量PCR檢測(real-time qPCR)、DNA微陣列芯片和二代測序等。Northern blot分析方法簡單易行，但靈敏度低、耗時長，重復性差且需要的總RNA量較大，不適合用于循環(huán)miRNA的檢測。微陣列芯片可以進行高通量的miRNA分析，但仍需足夠的初始樣本量，靈敏度亦不高。二代測序技術(shù)同樣可以實現(xiàn)miRNA的高通量檢測，但檢測成本較高，不適于臨床大樣本分析。

qPCR檢測通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累來實時監(jiān)測整個PCR進程，進而實現(xiàn)對起始未知含量模板的定量和定性分析。相比于Northern blot和微陣列分析，qPCR需要的樣本量較少，并且顯著提高了檢測范圍和靈敏度。但由于miRNA非常小，需要特殊設(shè)計的引物來實現(xiàn)PCR檢測。目前主要有兩種方式：poly(A)加尾法和莖環(huán)法。poly(A)加尾法利用poly(A)聚合酶使miRNA的3’端帶上一段poly(A)序列，然后利用Oligo(dT)序列引物進行逆轉(zhuǎn)錄。由于逆轉(zhuǎn)錄引物的通用性，降低了檢測成本，但同時也降低了檢測的靈敏性和特異性。莖環(huán)法通過莖環(huán)狀引物對miRNA進行逆轉(zhuǎn)錄，由于該莖環(huán)狀引物的5’端含有一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而3’端具有6個與成熟miRNA 3’端配對的特異性堿基，可以將短的成熟miRNA分子擴展并增加一個特異的3’引物位點，從而可以特異性的進行逆轉(zhuǎn)錄反應。

循環(huán)miRNA檢測為液體活檢的重要內(nèi)容，對腫瘤的早期診斷、療效評估和預后監(jiān)測具有重要價值。Imaoka等研究(Annals of Oncology 27:1879–1886,2016)指出結(jié)直腸腺癌患者血清miR-1290顯著升高，循環(huán)miR-1290可作為獨立的預后因素。Ang Li等研究(ClinCancer Res；19(13)JμLy 1,2013)發(fā)現(xiàn)miR-1290在胰腺癌血清中顯著升高，胰腺癌患者、慢性胰腺炎患者和胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者的受試者工作曲線(ROC)面積分別為0.96，0.81和0.80，循環(huán)miR-1290可作為胰腺癌早期診斷標志物。Francesca Tavano等研究(Sci Rep；8(1)Nov 6,2018)發(fā)現(xiàn)血漿miR-1290與CA 19-9聯(lián)合檢測較兩者分別單獨檢測，具有更強的診斷和鑒別效能。因此循環(huán)miR-1290是一個潛在的腫瘤標志物。

發(fā)明內(nèi)容