[發明專利]一種葉綠體DNA的富集方法

在審

• 申請號: 201910876698.6
• 申請日: 2019-09-17
• 公開（公告）號: CN110734907A
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發明（設計）人: 林芹;龍歡;袁方;陶曄;曾亮;林愛婷
• 申請（專利權）人: 上海凌恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 31260 上海晨皓知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 成麗杰

本發明屬于分子生物學技術領域，特別涉及一種葉綠體DNA的富集方法。本發明的方法基于植物細胞中的葉綠體DNA與細胞核DNA甲基化位點存在的差異，利用帶有蛋白A修飾的磁珠，通過MBD2?Fc蛋白媒介，將植物基因組DNA中的細胞核DNA和葉綠體DNA進行分離，并進一步實現對葉綠體DNA的富集。利用本發明的方法，在測序前進行葉綠體DNA的富集，然后對富集后的葉綠體DNA進行測序，可有效提高測序數據中葉綠體DNA序列的比例，顯著提高測序的準確度、降低測序成本。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，特別涉及一種植物葉綠體DNA的富集方法。

背景技術

葉綠體DNA測序已經被廣泛應用于分類學和系統進化的研究，完整的葉綠體DNA測序可以為復雜的進化關系提供有用的依據，提高物種的分類水平。與細胞核基因組相比，葉綠體基因組是母系單方面遺傳，在進化變異速度上較慢。通過二代測序發現的葉綠體基因組中的SNP和插入缺失突變可能成為未來不同分類水平上的分子標記。

植物的大多數遺傳物質都來源于細胞核，只有很少一部分來源于其他細胞器，所以對植物基因組進測序所得到的數據信息大多來源于細胞核DNA，而檢測到的葉綠體DNA非常少，特別是對于基因組較大的物種，例如水稻、小麥等，葉綠體DNA所占的比例就更少。將植物基因組DNA進行二代測序，從中過濾掉其他信息，篩選出葉綠體DNA信息的方法對與基因組較大的物種成本過高。這就需要我們尋找有效的方法去除植物細胞核DNA的干擾，獲得更多的葉綠體DNA。在現有的DNA提取方法的基礎上優化提取過程中鹽離子濃度和pH值所得到的葉綠體DNA存在細胞核DNA殘留，質量降低等問題，很難滿足后續測序要求。

此外，如采用蔗糖密度梯度離心法提取葉綠體DNA，耗時長，操作繁瑣，產率低，對設備要求高，密度梯度液不易保持。而采用DNaseI法提取葉綠體DNA，則藥品較貴，提取時間長，難以使葉綠體膜保持完整，導致葉綠體DNA的得率很低。

發明內容

本發明的目的在于提供一種葉綠體DNA的富集方法，以實現更高效率地針對植物的葉綠體DNA進行測序或其他分子生物學研究。

為解決上述技術問題，本發明所提供的葉綠體DNA的富集方法，包括：(1)提取植物基因組DNA；(2)使蛋白A修飾的磁珠與MBD2-Fc蛋白結合，得到處理后的磁珠；(3)將所述植物基因組DNA加入所述處理后的磁珠中，混勻，對混合物進行室溫下孵育；(4)對孵育后的混合物離心，于磁力架上靜置，細胞核DNA通過與磁珠上的MBD2-Fc蛋白結合而附著到磁珠上，葉綠體DNA保留在上清液中，取上清液；(5)使用磁珠對所述上清液中的葉綠體DNA進行回收。

與現有技術相比，本發明至少具有如下的有益效果：

本發明的申請人提出，植物細胞中細胞核DNA與葉綠體DNA的甲基化位點存在差異：植物細胞核DNA上存在很多甲基化位點，葉綠體DNA上的甲基化位點則非常少。而MBD2-Fc蛋白由兩部分組成：MBD2蛋白可以特異地跟甲基化的CpG結合，Fc是人類IgG上的Fc片段，它可與磁珠上的蛋白A結合。申請人利用帶有蛋白A修飾的磁珠，通過MBD2-Fc蛋白媒介，將植物基因組DNA中的細胞核DNA和葉綠體DNA分離，并進一步實現對葉綠體DNA的富集。

利用本發明的方法，即可通過簡便的操作、快速地在測序前對植物細胞中的細胞核DNA與葉綠體DNA進行分離、并對葉綠體DNA進行富集，然后對富集后的葉綠體DNA進行測序，可有效提高測序數據中葉綠體DNA序列的比例，顯著提高測序的準確度、降低測序成本。

優選地，步驟(1)中，在提取植物基因組DNA時，保證所述植物基因組DNA的完整性，并且完全去除植物蛋白，以免影響后續蛋白相互結合的實驗。

優選地，步驟(1)中，提取植物基因組DNA可使用試劑盒或其他植物基因組DNA的提取方法，例如可以選用的提取方法為：對待提取樣本使用蛋白酶K處理，然后用酚氯仿或酒精提取。