[發明專利]用于蛋白富集表達、胞內定位的新型標簽蛋白及其應用

有效

• 申請號: 201910875555.3
• 申請日: 2019-09-17
• 公開（公告）號: CN110551193B
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 宋俊祎;吳文健;胡碧茹
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍國防科技大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/85
• 代理公司: 長沙國科天河知識產權代理有限公司 43225
• 代理人: 邱軼

本發明涉及用于蛋白富集表達、胞內定位的新型標簽蛋白及其應用，所述標簽蛋白來源于烏賊虹細胞的膜上蛋白??反光蛋白A1(簡稱RA1)。用于蛋白富集表達、胞內定位的新型標簽蛋白的應用，包括以下步驟：(a)提供一種構建物，在基因表達載體的開放閱讀框內，從5’至3’段依次包含以下可操作性連接元件：eGFP的編碼基因，RA1的編碼基因；(b)將(a)的構建物轉入宿主細胞，從而表達eGFP，RA1標簽；(c)提供一組eGFP與RA1標簽構成的重組蛋白，所述重組蛋白含有eGFP與RA1功能區域，eGFP在RA1功能區域的作用下發揮：(d)細胞內富集與空間定位，并有利于后續分離純化。

技術領域

本發明屬于生物技術中的標簽蛋白技術領域，具體涉及用于蛋白富集表達、胞內定位的新型標簽蛋白及其應用。

背景技術

在后基因組時代的生物學研究當中，蛋白的功能分析是體外實驗的重要方面。實現重組蛋白快速、方便、經濟的表達便成為了前提條件。目前常用的蛋白表達體系包括大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞與哺乳動物細胞系統等。

在異源表達的過程當中，常常需要對目的蛋白的表達情況進行檢測，因此需要采用一系列的蛋白標簽進行標記、輔助。蛋白表達標簽在促進蛋白表達、協助蛋白檢測、實現蛋白純化等過程中具有至關重要的作用。

例如，將編碼目的蛋白的基因與熒光蛋白(eGFP、eCFP、eYFP)編碼基因進行拼接后，可直接通過熒光顯微鏡在細胞活體狀態下實時觀察目的蛋白在細胞中的亞細胞定位和表達情況；

例如，將目的基因與GST、TrxA等大分子標簽進行連接后，能夠促進目的蛋白的可溶性，促進蛋白正確折疊，提高穩定性，并提高蛋白的表達量；

例如，6*His、Flag和c-Myc等小分子標簽，則可提供簡便有效的目的蛋白純化途徑與檢測鑒定。

然而，在進行異源表達過程中存在著一個顯著的限制因素：外源蛋白在宿主細胞內的大量表達可能對細胞本身的生理代謝過程產生影響，降低細胞活性甚至致死，限制最終的蛋白產率，提高了生產成本。

因此，若能在異源表達過程中對外源蛋白在細胞內的空間分布進行限制，將在一定程度上緩解異源表達過程對宿主細胞產生的不良影響。

由此可見，具備對目的蛋白進行空間富集、分布約束的新型標簽蛋白的研究開發具有鮮明的應用需求和廣闊的市場前景。

發明內容

本發明的一個目的在于提供用于蛋白富集表達、胞內定位的新型標簽蛋白，所述標簽蛋白可使用在哺乳動物表達系統中，也可使用在原核、酵母、昆蟲表達系統中，可大量、快速地獲得具有高活性的同源重組蛋白質(即目的蛋白)，并可在細胞內進行目的蛋白富集與空間定位。

本發明的另一目的在于提供用于蛋白富集表達、胞內定位的新型標簽蛋白的應用，即利用新型富集表達、胞內定位標簽蛋白表達目的蛋白的方法。

一種新型富集表達、胞內定位標簽蛋白，所述標簽蛋白來源于烏賊虹細胞的膜上蛋白(Doryteuthis opalescens)--反光蛋白A1(Reflectin A1，以下簡稱RA1)；

所述標簽蛋白，是指在任何蛋白表達系統中，在目的蛋白的C(羧基)端加上RA1標簽后，利用RA1自身的自組裝和胞內定位特性，從而形成的蛋白表達系統，憑借RA1在細胞內的自組裝富集特性及特殊的胞內空間定位效應，可以促使目的蛋白發生自發富集、形成大型蛋白顆粒，有助于降低外源目的蛋白大量表達、無序分布對宿主細胞正常代謝過程可能產生的毒副作用，并有利于后續的分離純化工作。