[發明專利]基于環介導等溫擴增技術的牛結節性皮膚病檢測試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201910861380.0
• 申請日: 2019-09-12
• 公開（公告）號: CN111118211A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 李有志;劉彥崇;楊晶旭;李平;徐大財;盧慶國
• 申請（專利權）人: 山東岡津生物工程有限公司;楊晶旭
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京中索知識產權代理有限公司 11640
• 代理人: 周國勇

1.基于環介導等溫擴增技術的牛結節性皮膚病檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒含有以下特異性引物：

上游內引物FIP：

5’-ATCATTTCCAAATACAAGTGAGG-gtttttgattcttgtggaaaggtcg-3’；

下游內引物BIP：

5’-AACCTCCCTGGAGGAAAATGC-caacactatagtagtagtagactt-3’；

上游外引物F3：5’-CATGTTTTTGACAAAAGCTGTT-3’；

下游外引物B3：5’-ttcaacaaagccatctgtatca-3’。

2.根據權利要求1所述的基于環介導等溫擴增技術的牛結節性皮膚病檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還含有以下試劑中的一種或多種：

嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶、10×熱聚合反應緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物、硫酸鎂、甜菜堿、猴姑多糖和熒光染料賽博綠Ⅰ；

所述10×熱聚合反應緩沖液由濃度為250mmol/L、pH為8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、濃度為100mmol/L的氯化鉀、濃度為100mmol/L的硫酸銨、濃度為20mmol/L的硫酸鎂和質量分數為1％的曲拉通X-100組成；

所述三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸組成。

3.一種使用權利要求1所述的檢測試劑盒檢測牛結節性皮膚病的方法，其特征在于：包括以下步驟：

a、提取待檢樣品的細菌DNA作為模板DNA，控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值為1.6～2.0，濃度為10～100ng/μl；

b、牛結節性皮膚病的環介導等溫擴增：在反應管中配制總體積為25μl的環介導等溫擴增反應體系，所述反應體系由以下組分組成：濃度各為0.2μmol/L的上游內引物FIP和下游內引物BIP，濃度各為0.8μmol/L的上游外引物F3和下游外引物B3，8U嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶，1×熱聚合反應緩沖液，濃度各為1mmol/L的三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸，濃度為3mmol/L的硫酸鎂，濃度為1mol/L的甜菜堿，濃度為0.1～0.5mol/L的香菇多糖，待檢模板DNA水溶液1μl，余量為水；將反應管于60～65℃水浴中保溫反應30～90分鐘，再于80～95℃水浴中保溫3～5分鐘終止反應；

c、顯色檢測：在反應管中加入質量分數為10％的熒光染料賽博綠Ⅰ水溶液1μl，用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢樣品中不含有牛結節性皮膚病；如果顏色變為綠色，說明待檢樣品中含有牛結節性皮膚病。