[發明專利]基于環介導等溫擴增技術的牛結節性皮膚病檢測試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201910861380.0
• 申請日: 2019-09-12
• 公開（公告）號: CN111118211A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 李有志;劉彥崇;楊晶旭;李平;徐大財;盧慶國
• 申請（專利權）人: 山東岡津生物工程有限公司;楊晶旭
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京中索知識產權代理有限公司 11640
• 代理人: 周國勇

本發明公開了基于環介導等溫擴增技術的牛結節性皮膚病檢測試劑盒及方法，該試劑盒根據牛結節性皮膚病16S rRNA保守區的六個特異區域設計了兩條特異性內引物和兩條特異性外引物，可以特異地區分牛結節性皮膚病病毒與其它致病病毒，保證環介導等溫擴增的高度特異性和檢測結果的可靠性。本發明可以在等溫條件下高效、特異地擴增靶序列，且操作簡便，不需要昂貴的儀器和試劑，擴增產物直接用熒光染料顯色即可憑肉眼判斷結果，成本低，特別適合中小型單位和現場檢測應用。特別是在環介導等溫擴增體系中加入香菇多糖至終濃度為0.1～0.5mol/L，可部分替代普通LAMP試劑盒中昂貴的“甜菜堿”，可很好的促進高含量GC片段的擴增。

技術領域

本發明涉及一種生物檢測試劑盒及方法，特別涉及一種基于環介導等溫擴增技術的牛結節性皮膚病檢測試劑盒及方法。

背景技術

牛結節性皮膚病(Lumpy skin disease，LSD)，又稱牛結節疹、牛結節性皮炎或牛疙瘩皮膚病，是一種牛的痘病。病原是牛結節性皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)，屬于痘病毒科脊椎動物痘病毒亞科山羊痘病毒屬，與牛痘病毒并不同屬。該病的臨床特征包括發熱，皮膚、粘膜和內臟器官出現結節，機體消瘦，淋巴結腫大，皮膚水腫，部分病例會死亡。該病還能夠引起產奶量暫時性下降，引起公牛暫時或永久性不育，損壞皮張，甚至因為繼發細菌感染而導致動物死亡，從而對經濟造成嚴重的影響。該病是OIE的通報性疾病(OIE 2014年版名錄)，是我國《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》中的一類傳染病，澳大利亞(澳大利亞2013年版名錄)、加拿大(加拿大2014年版名錄)、美國(美國國家動物衛生通報系統疾病名錄)、歐盟(歐盟動物疫情通報系統疾病名錄)的通報性疾病。2010年以來，確認在此期間曾發生或正在發生該病的國家多達43個，分布于非亞歐三大洲，其中非洲疫情尤為嚴重。2019年8月12日，經中國動物衛生與流行病學中心國家外來動物疫病研究中心確診新疆維吾爾自治區伊犁州發生牛結節性皮膚病疫情，這是我國首次確診發生該病。該病的發病率在5％～45％之間，病死率達10％。該病不感染人，其危害主要在于引起牛病死率升高、牛皮質量下降、產奶量下降、體重增長緩慢，有時引起公牛暫時或永久性不育，甚至因為繼發細菌感染而導致病牛死亡，還可導致牛和牛產品出口受阻以及巨額的疫病控制與消滅成本，從而造成嚴重的經濟損失。

目前，牛結節性皮膚病(Lumpy skin disease，LSD)的檢測方法主要有分離培養鑒定法、聚合酶鏈式反應(PCR)法和熒光定量PCR(FQ-PCR)法，免疫熒光、瓊脂免疫擴散、ELISA等。但分離培養鑒定法操作繁瑣、費時，PCR法和 FQ-PCR及其他上述方法需要昂貴的儀器和試劑，檢測成本高，不適合中小型單位和現場檢測應用。

環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術與其它核酸擴增技術相比，可以在等溫條件下快速、高效、特異地擴增靶序列，且操作簡便，不需要昂貴的儀器和試劑，已在病原微生物檢測領域顯示出廣闊的發展前景。但至今尚未見基于環介導等溫擴增技術專門檢測牛結節性皮膚病 (Lumpy skin disease，LSD)的報道。

發明內容

有鑒于此，為克服現有技術的不足，本發明的目的之一在于提供一種基于環介導等溫擴增技術的牛結節性皮膚病(Lumpy skin disease，LSD)檢測試劑盒；目的之二在于提供一種使用所述基于環介導等溫擴增技術的牛結節性皮膚病 (Lumpy skin disease，LSD)檢測試劑盒檢測牛結節性皮膚病(Lumpy skin disease，LSD)的方法；靈敏度高，特異性好，操作簡便快速，結果準確可靠；目的三是進一步降低常規LAMP檢測成本，適合中小型單位和現場檢測應用。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明基于環介導等溫擴增技術的牛結節性皮膚病(Lumpy skin disease， LSD)檢測試劑盒，含有以下特異性引物：

上游內引物FIP：