[發明專利]一種高產DHA裂殖壺菌突變菌株的誘變育種方法

在審

• 申請號: 201910860231.2
• 申請日: 2019-09-11
• 公開（公告）號: CN112481250A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 劉憲華;李建濤;汪光義;張賽;葉會科
• 申請（專利權）人: 天津大學青島海洋技術研究院
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種高產DHA裂殖壺菌突變菌株的誘變育種方法，具體是，將野生型裂殖壺菌菌株經過兩輪ARTP誘變處理，搖瓶培養篩選后獲得高產菌株。本發明涉及到的高產DHA誘變育種方法具有操作簡單安全，應用范圍廣，誘變成功率高，能快速獲取大量目的突變體等諸多優勢。

技術領域

本發明涉及微生物遺傳育種技術領域，尤其涉及用于生產二十二碳六烯酸的裂殖壺菌突變株，即一種高產DHA裂殖壺菌突變菌株的誘變育種方法。

背景技術

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）是一種ω-3系列多不飽和脂肪酸，對維持人體的正常生理功能至關重要。DHA是細胞膜磷脂的組成成分，參與腦細胞和視網膜的正常發育，具有預防心血管疾病、高血脂等疾病的功效。隨著人們生活水平的不斷提高與對DHA生物醫藥價值的認識的不斷深化，DHA的需求量也不斷上升。

裂殖壺菌（Schizochytrium）是一種類真菌類的單細胞異養原生生物，具有生長速度快、細胞內DHA和脂肪酸含量高等優勢，可作為DHA生產的替代來源。

使用傳統的發酵優化策略已經很難再進一步提高DHA的產量，因此培育DHA高產微生物新菌株顯得尤為重要。常壓室溫等離子體（ARTP）新型誘變儀具有突變快、突變多樣性高、簡單易行等諸多優勢。

發明內容

針對現有技術不足，本發明一種高產DHA裂殖壺菌突變菌株的誘變育種方法，經過兩輪ARTP誘變，以搖瓶培養測得的DHA產量為依據，快速簡便獲取高產DHA新菌株。

一種高產DHA裂殖壺菌突變菌株的誘變育種方法中培養基（g/L）成分包括以下成分：

固體培養基：葡萄糖10，蛋白胨1.5，酵母膏0.1，瓊脂粉20，海鹽33，PH自然，1×10⁵ Pa、115 ℃滅菌21 min。發酵培養基：葡萄糖20，蛋白胨1.5，酵母膏1.0，KH₂PO₄ 0.25，海鹽33，PH自然，1×10⁵ Pa、115 ℃滅菌21 min。

一種高產DHA裂殖壺菌突變菌株的誘變育種方法，主要包括以下步驟：

（1）種子液制備：在無菌超凈臺中，使用接種環挑取新鮮固體培養基中的單菌落，接種在裝有40 mL液體培養基的錐形瓶內，在28℃、150 rpm搖床中培養24 -36 h；

（2）菌懸液制備：取5%的上述種子液接種至發酵液體培養基中，在28℃、150 rpm搖床中培養24-36 h，取適量菌液稀釋后，調整細胞OD₆₆₀ 值為0.3-0.4之間，用于ARTP誘變處理；

（3）ARTP兩輪誘變處理：分別取上述菌懸液10 μL均勻涂布在無菌載片上，將載片放于培養皿中并轉移至ARTP誘變儀凹槽內，凹槽下方固定座固定相應的EP管，用于承接載片，EP管內含有1 mL的無菌蒸餾水。ARTP誘變儀輻射時間為0、10、20、30、40、50、60 s，功率設定為120 W，氣量設定為10 SLM。誘變結束后，取出含有載片的EP管，震蕩1 min，使載片上的菌體完全重懸在EP管內，吸取80 μL重懸液涂布在M4固體平板上，放入28℃恒溫箱中培養2-3 d。統計生長出的單菌落個數，計算出ARTP誘變儀不同處理時間下的致死率，選擇致死率在90%左右的處理時間進行后續誘變處理依據；

以誘變致死率在90%左右的處理時間作為誘變儀的工作時間，第一次誘變處理后的突變體涂布在平板上，培養2-3 d，挑選出形態大可能高產的單菌落，以磷酸香草醛法篩選出油脂有明顯提高的誘變菌株作為第二次誘變輻照的出發菌株，實驗方法與第一次誘變相同；