[發(fā)明專利]識(shí)別豬ROSA26基因的sgRNA及其編碼DNA、基因編輯方法、試劑盒和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910856237.2
• 申請(qǐng)日: 2019-09-11
• 公開（公告）號(hào): CN110484538A
• 公開（公告）日: 2019-11-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉志國;李奎;牟玉蓮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/11;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 11463 北京超凡宏宇專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)
• 代理人: 李雙艷<國際申請(qǐng)>=<國際公布>=<進(jìn)入

本發(fā)明提供了一種識(shí)別豬ROSA26基因的sgRNA及其編碼DNA、基因編輯方法、試劑盒和應(yīng)用，涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。該特異性識(shí)別豬ROSA26基因的sgRNA識(shí)別豬ROSA26基因的第一內(nèi)含子，且用于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，含有如SEQ ID NO.1所示的負(fù)責(zé)識(shí)別靶片段的序列。該sgRNA配合CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，敲除效率為27％且特異性強(qiáng)，在進(jìn)行序列敲除時(shí)，能有效減少脫靶現(xiàn)象，減少非特異性切割對(duì)基因組帶來的不利影響。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種識(shí)別豬ROSA26基因的sgRNA及其編碼DNA、基因編輯方法、試劑盒和應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬是我國重要的家畜品種之一，其在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)、醫(yī)學(xué)疾病模型和分子遺傳學(xué)研究中均有重要地位。而基因編輯豬在生物學(xué)研究、農(nóng)業(yè)新品種培育以及生物醫(yī)藥研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)極大的提高了豬的基因編輯效率，但目前還存在脫靶風(fēng)險(xiǎn)高以及外源基因定點(diǎn)整合效率較低的問題。

ROSA26基因是基因編輯中的一個(gè)安全位點(diǎn)，外源基因在安全位點(diǎn)可以穩(wěn)定高效的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞和組織無副作用，缺失ROSA26基因?qū)?xì)胞和組織也無影響。

因此改進(jìn)對(duì)豬ROSA26基因進(jìn)行基因編輯以及外源基因定點(diǎn)整合的方法，獲取基因編輯或者外源基因定點(diǎn)整合的豬細(xì)胞或者個(gè)體，對(duì)豬的基因功能研究、新型基因編輯豬的制備和培育具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于提供一種特異性識(shí)別豬ROSA26基因的sgRNA，該sgRNA用于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，能夠特異性識(shí)別豬ROSA26基因的第一內(nèi)含子。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種含有編碼上述sgRNA的序列的DNA分子。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種上述特異性識(shí)別豬ROSA26基因的sgRNA或上述DNA分子的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明特采用如下技術(shù)方案：

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種特異性識(shí)別豬ROSA26基因的sgRNA，所述sgRNA用于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)；所述sgRNA含有如SEQ ID NO.1所示序列，所述SEQ ID NO.1所示序列負(fù)責(zé)識(shí)別靶片段。

優(yōu)選地，所述sgRNA含有如SEQ ID NO.3所示序列。

優(yōu)選地，所述豬ROSA26基因的第1內(nèi)含子含有如SEQ ID NO.5所示序列。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了含有編碼上述sgRNA的序列的DNA分子。

優(yōu)選地，所述DNA分子含有如SEQ ID NO.2所示序列，所述SEQ ID NO.2編碼所述sgRNA負(fù)責(zé)識(shí)別靶片段的部分。

優(yōu)選地，所述DNA分子含有如SEQ ID NO.4所示序列，所述SEQ ID NO.4編碼全長所述sgRNA。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種對(duì)豬基因組中ROSA26基因進(jìn)行基因編輯的方法，該方法包括將(a)和(b)導(dǎo)入豬源生物材料中，以對(duì)豬基因組中ROSA26基因進(jìn)行編輯；

(a)上述sgRNA或上述DNA分子；

(b)Cpf1分子，所述Cpf1分子包括Cpf1蛋白分子或Cpf1核酸分子。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包含上述sgRNA、或上述DNA分子。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了上述sgRNA、上述DNA分子、上述方法或上述試劑盒在對(duì)豬進(jìn)行基因編輯中的應(yīng)用。