[發(fā)明專利]制備BEM用于純化固定化帶有AcmA重組蛋白的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910854616.8
• 申請(qǐng)日: 2019-09-10
• 公開（公告）號(hào): CN110628746A
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓燁;趙芳坤;肖華志;周志江
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/26
• 分類號(hào): C12N9/26;C12N1/20;C12R1/07;C12R1/42;C12R1/445;C12R1/265;C12R1/19
• 代理公司: 12201 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所
• 代理人: 琪琛

本發(fā)明公開了一種利用GEM去除重組蛋白內(nèi)毒素的方法，它涉及一種去除大腸桿菌表達(dá)重組蛋白中內(nèi)毒素的方法，蛋白?AcmA融合蛋白重組表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)后利用GEM(革蘭氏陽(yáng)性基質(zhì))進(jìn)行純化固定化，然后利用Triton X?114處理固定化蛋白以去除內(nèi)毒素。該方法可以在低溫(4℃)下進(jìn)行內(nèi)毒素的去除工作，避免溫度改變影響蛋白活性，并簡(jiǎn)化去除內(nèi)毒素操作。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用細(xì)菌菌體制備新型材料BEM用于純化固定化帶有AcmA的重組蛋白的方法。

背景技術(shù)

酶的固定化對(duì)于酶的應(yīng)用具有重要意義，通過(guò)固定化，可以使昂貴的酶得到回收利用，同時(shí)能夠避免在反應(yīng)體系中引入新的蛋白雜質(zhì)。酶的固定化被廣泛應(yīng)用于工業(yè)催化、發(fā)酵、食品等領(lǐng)域。用于固定化的酶可以利用產(chǎn)酶菌株發(fā)酵，從天然產(chǎn)物中分離純化，也可以通過(guò)重組表達(dá)來(lái)得到。重組表達(dá)可以提高酶的產(chǎn)量，通過(guò)添加適當(dāng)標(biāo)簽，可以進(jìn)行親和層析等方法進(jìn)行純化。這些方法需要多步進(jìn)行，同時(shí)也需要一些化學(xué)試劑如硫酸銨、咪唑等。因此這些方法存在著周期長(zhǎng)、酶活損失等缺點(diǎn)。

細(xì)菌可以產(chǎn)多種天然產(chǎn)物，包括細(xì)菌素、胞外多糖、酶等。多種細(xì)菌被分離篩選以用于生產(chǎn)各種產(chǎn)物。在產(chǎn)完天然產(chǎn)物以后，大量的細(xì)菌菌體需要被處理。部分乳酸菌和芽孢桿菌可以作為益生菌應(yīng)用，但是野生菌需要經(jīng)過(guò)大量的工作才有可能被用于益生菌。需要為細(xì)菌的菌體尋找利用的方法。

細(xì)菌細(xì)胞壁的主要組分是肽聚糖，包括革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌，其區(qū)別之一就是肽聚糖含量的高低。乳酸乳球菌的肽聚糖水解酶AcmA的C端的蛋白錨定域可以與肽聚糖特異的結(jié)合。利用這個(gè)特性，通過(guò)酸煮沸細(xì)菌(包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌)可以得到無(wú)生命的細(xì)菌增強(qiáng)基質(zhì)(Bacterial enhancer matrix particles，BEM)。BEM可以用于純化固定化帶有AcmA標(biāo)簽的重組蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

本方法的目的在于提供一種制備BEM用于純化固定化帶有AcmA重組蛋白的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中純化固定化帶有AcmA的重組蛋白方法存在著周期長(zhǎng)、酶活損失的問(wèn)題。

本發(fā)明一種利用細(xì)菌菌體制備新型材料BEM用于純化固定化帶有AcmA的重組蛋白的方法，按照以下步驟進(jìn)行：

1)制備帶有AcmA標(biāo)簽的重組α-淀粉酶，作為純化固定化酶的來(lái)源(可溶性酶及包涵體)；

2)培養(yǎng)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(包括乳酸菌、芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌等)、革蘭氏陰性細(xì)菌(大腸桿菌、沙門氏菌)；

3)收集菌體，利用0.1M-0.2M的HCl或TCA煮沸菌體30-60分鐘；

4)離心收集沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗滌沉淀，得到BEM；

5)將BEM調(diào)整至相同濃度，用于純化固定化帶有AcmA標(biāo)簽的重組α-淀粉酶；

6)測(cè)定不同BEM純化固定化的酶活，并進(jìn)行SDS-PAGE；

7)利用8M尿素溶解包涵體，利用制備的BEM從包涵體的尿素變性中回收酶活；

8)測(cè)定不同BEM純化固定化包涵體中的酶活，并進(jìn)行SDS-PAGE。

在步驟1)中，培養(yǎng)帶有質(zhì)粒pET28a-α-amylase-AcmA的大腸桿菌BL21，利用IPTG誘導(dǎo)，收集菌體后超聲破碎并離心，得到帶有AcmA標(biāo)簽的重組α-淀粉酶，得到的上清作為可溶性的純化固定化酶來(lái)源，沉淀作為從包涵體中回收酶活的來(lái)源。

在步驟2)中，利用最適培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌(8種)，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌(2種)、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌。在最適溫度下培養(yǎng)。