[發(fā)明專利]制備BEM用于純化固定化帶有AcmA重組蛋白的方法在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201910854616.8 | 申請(qǐng)日： | 2019-09-10 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN110628746A | 公開（公告）日： | 2019-12-31 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 韓燁;趙芳坤;肖華志;周志江 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 天津大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12N9/26 | 分類號(hào)： | C12N9/26;C12N1/20;C12R1/07;C12R1/42;C12R1/445;C12R1/265;C12R1/19 |
| 代理公司： | 12201 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 | 代理人： | 琪琛 |
| 地址： | 300350 天津市津南區(qū)海*** | 國(guó)省代碼： | 天津;12 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 內(nèi)毒素 去除 重組蛋白 大腸桿菌表達(dá) 重組表達(dá)載體 革蘭氏陽(yáng)性 固定化蛋白 融合蛋白 影響蛋白 誘導(dǎo)表達(dá) 固定化 基質(zhì) 蛋白 | ||
1.制備BEM用于純化固定化帶有AcmA重組蛋白的方法，其特征在于，包括如下步驟：
1)制備帶有AcmA標(biāo)簽的重組α-淀粉酶，作為純化固定化酶的來源；
2)培養(yǎng)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌；
3)收集菌體，利用0.1M-0.2M的HCl或TCA煮沸菌體30-60分鐘；
4)離心收集沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗滌沉淀，得到BEM；
5)將BEM調(diào)整至相同濃度，用于純化固定化帶有AcmA標(biāo)簽的重組α-淀粉酶；
6)測(cè)定不同BEM純化固定化的酶活，并進(jìn)行SDS-PAGE；
7)利用8M尿素溶解包涵體，利用制備的BEM從包涵體的尿素變性中回收酶活；
8)測(cè)定不同BEM純化固定化包涵體中的酶活，并進(jìn)行SDS-PAGE。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備BEM用于純化固定化帶有AcmA重組蛋白的方法，其特征在于，所述步驟1)培養(yǎng)帶有質(zhì)粒pET28a-α-amylase-AcmA的大腸桿菌BL21，利用IPTG誘導(dǎo)，收集菌體后超聲破碎并離心，得到帶有AcmA標(biāo)簽的重組α-淀粉酶，得到的上清作為可溶性的純化固定化酶來源，沉淀作為從包涵體中回收酶活的來源。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備BEM用于純化固定化帶有AcmA重組蛋白的方法，其特征在于，所述步驟2)利用最適培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)8種乳酸菌，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)2種芽孢桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌，在最適溫度下培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備BEM用于純化固定化帶有AcmA重組蛋白的方法，其特征在于，所述步驟3)通過高速離心收集菌體，轉(zhuǎn)速選擇從4000rpm-10000rpm，溫度從4℃至室溫，離心10分鐘至30分鐘，棄上清，將菌體重懸于0.1M-0.2M的HCl或TCA中，煮沸30-60分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備BEM用于純化固定化帶有AcmA重組蛋白的方法，其特征在于，所述步驟4)利用離心收集上一步煮沸得到的沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗滌沉淀，得到不同細(xì)菌制備的BEM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備BEM用于純化固定化帶有AcmA重組蛋白的方法，其特征在于，所述步驟5)將制備得到的BEM調(diào)整至相同濃度以測(cè)定其結(jié)合能力，離心收集后棄上清，分別與步驟1)得到的上清結(jié)合以純化固定化重組α-淀粉酶，結(jié)合時(shí)間為30-50分鐘，4000rmp離心分離，用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗滌沉淀。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備BEM用于純化固定化帶有AcmA重組蛋白的方法，其特征在于，所述步驟6)將上一步純化固定化的酶測(cè)定酶活，利用DNS法測(cè)定酶活；將不同BEM純化固定化的酶進(jìn)行SDS-PAGE。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備BEM用于純化固定化帶有AcmA重組蛋白的方法，其特征在于，所述步驟7)利用8M尿素溶解步驟1)得到的包涵體，充分溶解后12000rpm離心，取上清與制備的BEM混勻，室溫下結(jié)合20-50分鐘，12000rpm離心分離，取沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分清洗以去除非特異性結(jié)合和尿素，將結(jié)合有重組蛋白的BEM重懸于50mM的Tri-HCl(pH7.2)中，4℃過夜復(fù)性。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備BEM用于純化固定化帶有AcmA重組蛋白的方法，其特征在于，所述步驟8)利用DNS法測(cè)定酶活，將不同BEM純化固定化的酶進(jìn)行SDS-PAGE。
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