[發明專利]一種人二倍體細胞ZFB細胞及其構建方法、規模化培養方法

在審

• 申請號: 201910851946.1
• 申請日: 2019-09-10
• 公開（公告）號: CN111004772A
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發明（設計）人: 蔣仁生;徐文龍;沈慧莉;靳正偉;陶立峰;譚小東;楊世龍
• 申請（專利權）人: 安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司;重慶智飛生物制品股份有限公司;北京智飛綠竹生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 北京知聯天下知識產權代理事務所(普通合伙) 11594
• 代理人: 張陸軍;張迎新

本發明公開一種人二倍體細胞ZFB細胞及其構建方法、規模化培養方法，細胞的分類命名為ZFB?2，保藏編號為CGMCC No.17481；ZFB?3，保藏編號為CGMCC No.17482；ZFB細胞株的構建方法，包括如下步驟：取胚胎組織塊貼壁培養；細胞長成致密單層時，采用含10％胎牛血清的MEM培養液培養上述單層細胞并傳代；棄去細胞培養上清液，消化，凍存；ZFB細胞的規模化培養方法，包括如下步驟：取工作細胞庫的ZFB細胞株，接種于一級生物反應器中進行細胞的擴增；取一級生物反應器中覆蓋滿細胞的微載體，洗滌，再加入含有0.1％膠原蛋白酶的胰蛋白酶，消化；然后接種于二級生物反應器進行培養。本發明提出的ZFB?2細胞、ZFB?3細胞狀態良好，生長快速、傳代壽命長，對病毒的敏感性高，便于廣泛使用。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種人二倍體細胞ZFB細胞及其構建方法、規模化培養方法。

背景技術

人二倍體細胞是從人體正常組織(通常來源于胚胎)中分離的，并在體外培養傳代建立的細胞株。人二倍體細胞(如WI-38、MRC-5、KMB-17、2BS等) 具有有限的生長代次，傳代壽命一般在40-60代，超過一定的代次后細胞將停止增殖，并逐漸衰老、死亡。在其傳代壽命內，人二倍體細胞具有廣泛的病毒敏感性，良好的穩定性，無致瘤性。除終末代次的細胞會出現低概率的染色體條數和結構異常的外，其他代次的人二倍體細胞基本上能保持二倍體核型，與原代細胞相比，人二倍體細胞可以建立成熟的細胞庫系統，并且能夠達到充分鑒定和標準化的水平，從而有利于質量控制。與連續傳代細胞相比，人二倍體細胞理論上沒有致瘤性的危險。從上個世紀60年代，人二倍體細胞被國際接受用于生產疫苗以來，已經有數以十億劑的人二倍體細胞生產的病毒疫苗服務于全球，并且人二倍體細胞生產的病毒疫苗被證實是安全有效的。人二倍體細胞已被世界衛生組織(World Health Organization，簡稱“WHO”)推薦為較為安全的病毒性疫苗生產用細胞基質。

人二倍體細胞株具有極為廣泛的病毒易感性，為病毒研究和病毒診斷增添了新的手段(Fortunato,2014)。據不完全統計，二倍體細胞對大約200種病毒易感。在國外，用于病毒培養并建立細胞庫的主要人二倍體細胞是WI-38和 MRC-5。但是考慮到WI-38細胞因為檢測到曾被污染，現已不用于疫苗生產。 MRC-5細胞因為WHO授權的細胞數量稀少，加之二倍體細胞自身代次有限，目前生產用一般最高為35代，導致抗原產量嚴重受限，而且多種病毒在該種細胞上適應的病毒滴度有待提高，特別是乙腦病毒。因此，需要一種傳代壽命長、病毒敏感性高的人二倍體細胞。

發明內容

針對上述問題，本發明公開了一種人二倍體細胞ZFB細胞，該細胞的分類命名為人胚肺纖維細胞ZFB-2，保藏編號為CGMCC No.17481。

一種人二倍體細胞ZFB細胞，該細胞的分類命名為人胚肺纖維細胞ZFB-3，保藏編號為CGMCC No.17482。

一種人二倍體細胞ZFB細胞株的構建方法，包括如下步驟：

步驟一、取胚胎組織塊漂洗至組織塊發白，將組織塊轉移至細胞培養瓶中加入MEM培養液貼壁培養；

步驟二、到達預設時間后換液，觀察，直至細胞長成致密單層細胞；

步驟三、采用含10％胎牛血清的MEM培養液培養所述單層細胞并傳代；

步驟四、細胞傳代完成后，棄去細胞培養上清液，加入胰蛋白酶消化，消化后加入細胞凍存液、分裝入細胞凍存管凍存。

進一步地，所述步驟三中細胞傳代頻率為2-3天傳代一次，且每次傳代按 1:2-1:4分種率接種。

進一步地，所述步驟三中傳代第3-8代為原始細胞庫，第15-16代為主細胞庫，第20-21代為工作細胞庫。

一種人二倍體細胞ZFB細胞的規模化培養方法，包括如下步驟：