[發(fā)明專利]一種人二倍體細(xì)胞ZFB細(xì)胞及其構(gòu)建方法、規(guī)模化培養(yǎng)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910851946.1
• 申請(qǐng)日: 2019-09-10
• 公開（公告）號(hào): CN111004772A
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣仁生;徐文龍;沈慧莉;靳正偉;陶立峰;譚小東;楊世龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司;重慶智飛生物制品股份有限公司;北京智飛綠竹生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/073
• 分類號(hào): C12N5/073
• 代理公司: 北京知聯(lián)天下知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11594
• 代理人: 張陸軍;張迎新

1.一種人二倍體細(xì)胞ZFB細(xì)胞，其特征在于：該細(xì)胞的分類命名為人胚肺纖維細(xì)胞ZFB-2，保藏編號(hào)為CGMCC No.17481。

2.一種人二倍體細(xì)胞ZFB細(xì)胞，其特征在于：該細(xì)胞的分類命名為人胚肺纖維細(xì)胞ZFB-3，保藏編號(hào)為CGMCC No.17482。

3.一種人二倍體細(xì)胞ZFB細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟一、取胚胎組織塊漂洗至組織塊發(fā)白，將組織塊轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入MEM培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)；

步驟二、到達(dá)預(yù)設(shè)時(shí)間后換液，觀察，直至細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層細(xì)胞；

步驟三、采用含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)所述單層細(xì)胞并傳代；

步驟四、細(xì)胞傳代完成后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入胰蛋白酶消化，消化后加入細(xì)胞凍存液、分裝入細(xì)胞凍存管凍存。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種人二倍體細(xì)胞ZFB細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟三中細(xì)胞傳代頻率為2-3天傳代一次，且每次傳代按1:2-1:4分種率接種。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種人二倍體細(xì)胞ZFB細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟三中傳代第3-8代為原始細(xì)胞庫，第15-16代為主細(xì)胞庫，第20-21代為工作細(xì)胞庫。

6.一種如權(quán)利要求1或2所述人二倍體細(xì)胞ZFB細(xì)胞的規(guī)模化培養(yǎng)方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟一、取細(xì)胞庫代次為20代或21代的ZFB細(xì)胞株，加入到細(xì)胞生長(zhǎng)液中，利用胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代擴(kuò)增，制成細(xì)胞懸液并接種于一級(jí)生物反應(yīng)器中進(jìn)行細(xì)胞的擴(kuò)增；

步驟二、取微載體經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液水化后滅菌，加入無菌的一級(jí)生物反應(yīng)器和二級(jí)生物反應(yīng)器中，用細(xì)胞生長(zhǎng)液孵育微載體；

步驟三、取所述一級(jí)生物反應(yīng)器中覆蓋滿細(xì)胞的微載體，加入預(yù)熱的磷酸緩沖鹽溶液洗滌，再加入含有0.1％膠原蛋白酶的胰蛋白酶，消化細(xì)胞；

步驟四、將消化后的細(xì)胞和微載體懸液混勻，接種于二級(jí)生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種人二倍體細(xì)胞ZFB細(xì)胞的規(guī)模化培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟一中消化后的細(xì)胞傳代至若干個(gè)十層細(xì)胞工廠，且傳代率為1:3。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種人二倍體細(xì)胞ZFB細(xì)胞的規(guī)模化培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟一中一級(jí)生物反應(yīng)器擴(kuò)增細(xì)胞的培養(yǎng)參數(shù)為：溫度37℃，轉(zhuǎn)速40～50rpm，溶氧30～50％，pH為7.2～7.3，堿自動(dòng)控制。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種人二倍體細(xì)胞ZFB細(xì)胞的規(guī)模化培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟一中，待ZFB細(xì)胞匯合率達(dá)到90％以上時(shí)，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種人二倍體細(xì)胞ZFB細(xì)胞的規(guī)模化培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟二中所述一級(jí)生物反應(yīng)器與所述二級(jí)生物反應(yīng)器微載體使用總量為1:3～1:5。

11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種人二倍體細(xì)胞ZFB細(xì)胞的規(guī)模化培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟二中細(xì)胞生長(zhǎng)液孵育微載體時(shí)設(shè)置參數(shù)為：溫度36～38℃，轉(zhuǎn)速40～50rpm，溶氧30～50％，pH為7.2～7.4。

12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種人二倍體細(xì)胞ZFB細(xì)胞的規(guī)模化培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟三中待90％細(xì)胞消化脫離微載體得到分散均勻的細(xì)胞懸液，所述一級(jí)生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)速設(shè)置為50rpm，添加細(xì)胞生長(zhǎng)液，收集消化的細(xì)胞和微載體懸液。