[發明專利]一種可以改善全基因組甲基化測序偏向性的建庫方法

有效

• 申請號: 201910851085.7
• 申請日: 2019-09-10
• 公開（公告）號: CN112553298B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 羅慧娟;楊琴;羅甜;于源;吳逵;李旺勝;辜倫達;李南南;陳小芳
• 申請（專利權）人: 深圳華大生命科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 何葉喧

本發明公開了一種可以改善全基因組甲基化測序偏向性的建庫方法。本發明提供了一種制備甲基化測序文庫的方法，依次包括如下步驟：(1)在同一體系內進行雙鏈DNA片段的末端修復和加A；在末端修復和加A的反應體系中，加入的脫氧核糖核苷酸為dATP、dTTP和dGTP(不加入dCTP)，加入的酶包括DNA?Polymerase?I；(2)連接甲基化修飾接頭；(3)進行亞硫酸鹽處理。本發明具有操作簡單，周期短的優點，可對高甲基化修飾的樣本進行更為準確的甲基化檢測，可提供適用于任何物種的5甲基胞嘧啶全基因組甲基化檢測技術服務。

技術領域

本發明涉及一種可以改善全基因組甲基化測序偏向性的建庫方法。

背景技術

胞嘧啶第五個碳分子的DNA甲基化修飾是一種穩定的表觀遺傳修飾，在許多物種中從細菌到高等真核生物都存在此修飾。這種修飾就是我們常說的DNA甲基化修飾，它在胚胎發育過程的轉錄調節中發揮作用，例如基因組印記，轉座子沉默，另外在干細胞分化期間以及X染色體失活中也起著重要的作用。而且在腫瘤研究中發現DNA甲基化水平的變化也與腫瘤的進展有關。因此，DNA甲基化檢測為生物體的生理功能的研究提供了重要的手段。

基于重亞硫酸鹽原理的甲基化建庫測序已經成為DNA甲基化分析的金標準。基因組DNA經過重亞硫酸鹽處理后，未經修飾的胞嘧啶會轉化為尿嘧啶，而甲基化修飾的胞嘧啶則保持不變，經過PCR和測序后可以通過單堿基分辨率獲取基因組范圍內的甲基化信息。隨著NGS測序成本減少，WGBS(全基因組甲基化測序)方法越來越多地用于基礎和臨床研究。

傳統的WGBS流程中，首先將基因組DNA隨機打斷，得到具有平末端以及3'或5'突出端的片段化DNA。隨后使用T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶和Klenow聚合酶將突出端轉化為平末端。接下來鈍性DNA在Klenow(3'-5'exo-)酶作用下在3’端加入“A”，然后將帶有突出T的甲基化修飾接頭在T4DNA連接酶作用下連接到上述產物中。這時候再進行重亞硫酸鹽處理，插入片段上的沒有甲基化C就會脫氨基形成U，進一步通過PCR轉換成T，從而得到上機測序的產物。

傳統的WGBS中，對粘性末端DNA進行修復時，引入的寡聚核苷酸通常是A、T、C、G這四種堿基。這樣會造成粘性末端引入虛假的甲基化信息的情況。如果打斷后的粘性末端的胞嘧啶是高甲基化修飾，其所得到的CG甲基化水平就會出現嚴重的偏向性，導致落在此位點的甲基化信息出現重大偏差。盡管后續可以在信息分析的時候將出現這種情況的片段截去，但是，隨之帶來測序數據的浪費以及降低覆蓋度等問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種可以改善全基因組甲基化測序偏向性的建庫方法。

本發明提供了一種制備甲基化測序文庫的方法，依次包括如下步驟：

(1)在同一體系內進行雙鏈DNA片段的末端修復和加A；在末端修復和加A的反應體系中，加入的脫氧核糖核苷酸為dATP、dTTP和dGTP(不加入dCTP)，加入的酶包括DNAPolymerase?I；

(2)連接甲基化修飾接頭；

(3)進行亞硫酸鹽處理。

在末端修復和加A的反應體系中，加入的酶不包括T4DNA?Polymerase(不加入T4DNA?Polymerase)(用DNA?Polymerase?I代替T4DNA?Polymerase)。

在末端修復和加A的反應體系中，加入的酶為T4Polynucleotide?Kinase、KlenowFragment、rTaq?DNA?Polymerase和DNA?Polymerase?I。

所述雙鏈DNA片段可為100-300bp的DNA片段。

所述雙鏈DNA片段可為基因組DNA進行打斷得到的DNA片段。

所述打斷的方法具體可為采用打斷儀進行打斷。