[發明專利]一種昆蟲體內生物素含量測定方法

有效

• 申請號: 201910850178.8
• 申請日: 2019-09-10
• 公開（公告）號: CN110618281B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發明（設計）人: 欒軍波;任飛榮;白冰
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: G01N33/82
• 分類號: G01N33/82
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司 21101
• 代理人: 張述學

本發明涉及一種昆蟲體內生物素含量測定方法，包括以下步驟：（1）昆蟲樣品提取處理；（2）配制生物素梯度溶液；（3）制備生物素測定培養液；（4）生物素測定；本檢測方法所用的植物乳酸桿菌、各類培養基等均為市場常見菌株或耗材，成本低，顯著降低生物素檢測的成本，培養方法簡單；本發明檢測時間為22小時，比商業化試劑盒檢測時間縮短了22?26小時，提高了昆蟲維生素檢測的效率。

技術領域

本發明涉及一種測定方法，具體是涉及一種昆蟲體內生物素含量測定方法。

背景技術

B族維生素是動物不可缺少的一種營養元素。B族維生素是動物體內多種酶的輔酶。生物素（維生素B7），是乙酰輔酶a的輔酶。易溶于水，對酸穩定，易被堿破壞。對生命體代謝過程有至關重要的影響。對生物體內生物素定量檢測是研究生命代謝的基礎。目前對其檢測方法主要有微生物法、熒光分析、分光光度法、電化學方法以及高效液相色譜法或高效毛細管電泳法等。但這些方法常用于食品和飼料生物素檢測。

昆蟲體內生物素測定方法研究較少，僅見臭蟲等采用高效液相測定了體內生物素含量，其中測定結果包括無物活性的生物素，并且目前尚未有報道采用微生物法測定昆蟲生物素含量。目前市場上使用微生物法檢測生物素的試劑盒用于食品中生物素檢測，檢出限范圍較小，檢測時間較長需要44-48h，價格昂貴，每次檢測費用大約5000元，并且難以用于小型昆蟲的生理科學研究。

發明內容

為了彌補上述現有技術的不足，本發明的目的是提出一種昆蟲體內生物素含量測定方法，采用微生物法測定昆蟲生物素含量，顯著降低了生物素檢測的成本，提高了檢測效率。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的，一種昆蟲體內生物素含量測定方法，其技術要點是，包括以下步驟：

（1）昆蟲樣品提取處理

取20-50 mg 昆蟲樣品，用100μL檸檬酸鹽緩沖液研磨，加入1mol/L硫酸200μL；95度水浴2h，期間震蕩5次，用濃度為2mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7，并定容至5ml；

（2）配制生物素梯度溶液

a. 制備濃度為100 μg/mL生物素標準儲備液；

b. 制備濃度為1 μg/mL生物素標準中間液；

c. 制備濃度為10 ng/mL生物素標準工作液；

d. 制備0.0-0.8 ng/mL的生物素梯度溶液；

（3）制備生物素測定培養液

a. 微生物菌株的制備

所述微生物菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus Plantarum）；所述植物乳桿菌的培養基為乳酸桿菌瓊脂培養基和乳酸桿菌肉湯培養基；

所述植物乳桿菌菌株培養方法：對植物乳桿菌進行3-5代菌株培養。

所述第1代植物乳桿菌菌株培養采用乳酸桿菌瓊脂培養基上劃線培養，37℃培養18h；

所述第2代植物乳桿菌菌株培養：挑取第一代單菌落于乳酸桿菌肉湯培養基中，37℃培養18h，得到乳酸桿菌肉湯菌液；

所述第3代植物乳桿菌菌株培養：取第2代乳酸桿菌肉湯菌液于乳酸桿菌肉湯培養基中，37℃培養18h；

所述第4代和第5代植物乳桿菌菌株培養，按照第3代培養方法，均取上一代植物乳酸桿菌肉湯菌液至乳酸桿菌肉湯培養基中進行培養，37℃培養18h；

所述第3-5植物乳酸桿菌肉湯菌液2200rpm離心，3min；棄上清液，加生理鹽水混勻洗菌，重復洗菌3次后，用生理鹽水調菌液OD_630nm：0.8-0.95，得到備用植物乳酸桿菌菌液；