[發(fā)明專利]一種昆蟲體內(nèi)生物素含量測(cè)定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910850178.8
• 申請(qǐng)日: 2019-09-10
• 公開（公告）號(hào): CN110618281B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 欒軍波;任飛榮;白冰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/82
• 分類號(hào): G01N33/82
• 代理公司: 沈陽(yáng)科威專利代理有限責(zé)任公司 21101
• 代理人: 張述學(xué)

1.一種昆蟲體內(nèi)生物素含量測(cè)定方法，其特征是：包括以下步驟：

（1）昆蟲樣品提取處理

取20-50 mg 昆蟲樣品，用100μL檸檬酸鹽緩沖液研磨，加入1mol/L硫酸200μL；95度水浴2h，期間震蕩5次，用濃度為2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7，并定容至5ml；

（2）配制生物素梯度溶液

a. 制備濃度為100 μg/mL生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；

b. 制備濃度為1 μg/mL生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液；

c. 制備濃度為10 ng/mL生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液；

d. 制備濃度為0.0-0.8 ng/mL的生物素梯度溶液；

（3）制備生物素測(cè)定培養(yǎng)液

a. 微生物菌株的制備

所述微生物菌株為植物乳桿菌；所述植物乳桿菌的培養(yǎng)基為乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基和乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基；

所述植物乳桿菌菌株培養(yǎng)方法：對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行3-5代菌株培養(yǎng)；

所述第1代植物乳桿菌菌株培養(yǎng)采用乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18h；

所述第2代植物乳桿菌菌株培養(yǎng)：挑取第一代單菌落于乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h，得到乳酸桿菌肉湯菌液；

所述第3代植物乳桿菌菌株培養(yǎng)：取第2代乳酸桿菌肉湯菌液于乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h；

所述第4代和第5代植物乳桿菌菌株培養(yǎng)，按照第3代培養(yǎng)方法，均取上一代植物乳酸桿菌肉湯菌液至乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18h；

所述第3-5代植物乳酸桿菌肉湯菌液2200rpm離心，3min；棄上清液，加生理鹽水混勻洗菌，重復(fù)洗菌3次后，用生理鹽水調(diào)菌液OD_630nm：0.8-0.95，得到備用植物乳酸桿菌菌液；

b. 生物素測(cè)定培養(yǎng)液的制備

將游離生物素培養(yǎng)基于95℃水浴30min，迅速降至室溫，每隔10min，搖勻一次；過濾滅菌代用；將上述備用植物乳酸桿菌菌液按1:100比例加入游離生物素培養(yǎng)基中混勻，得到生物素測(cè)定培養(yǎng)液；

（4）生物素測(cè)定

a. 樣品處理

將昆蟲樣品和生物素梯度濃度溶液分別與生物素測(cè)定培養(yǎng)液混合，質(zhì)量體積比為昆蟲樣品或生物素梯度濃度溶液:生物素測(cè)定培養(yǎng)液=1:1，將上述處理樣品均置于37 ℃培養(yǎng)22h后，取各樣品至于潔凈的微孔板中，630nm測(cè)定OD值；

b. 建立生物素測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)各生物素梯度濃度溶液與生物素測(cè)定培養(yǎng)液混合培養(yǎng)后測(cè)定得到的OD值，以生物素含量標(biāo)準(zhǔn)系列為橫坐標(biāo)，以630nm光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程；

c. 昆蟲樣品中生物素含量計(jì)算

以昆蟲樣品與生物素測(cè)定培養(yǎng)液混合培養(yǎng)后測(cè)定得到的OD值為生物素測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的Y值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相對(duì)應(yīng)的生物素濃度，各昆蟲樣品的生物素含量通過下列公式計(jì)算：

其中：

N: 樣品中生物素的含量，單位為納克每毫克；

c:生物素測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算所得生物素的濃度，單位為納克每毫升；

v：步驟（1）樣品提取后定容體積，單位為毫升；

m：昆蟲質(zhì)量，單位為毫克；

F：樣品提取后定容體積的稀釋倍數(shù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種昆蟲體內(nèi)生物素含量測(cè)定方法，其特征是：所述昆蟲為半翅目昆蟲。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種昆蟲體內(nèi)生物素含量測(cè)定方法，其特征是：所述步驟（2）中生物素梯度溶液濃度依次為0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 ng/mL的生物素梯度溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種昆蟲體內(nèi)生物素含量測(cè)定方法，其特征是：通過所述測(cè)定方法測(cè)得昆蟲生物素含量超過1.0 ng/mL時(shí)，將步驟（1）中昆蟲樣品提取定容體積進(jìn)行稀釋，再進(jìn)行步驟（4）；昆蟲生物素含量低于0.1 ng/mL時(shí)，重新提取昆蟲樣品或增加昆蟲樣品質(zhì)量，再進(jìn)行步驟（4）。