[發明專利]腎臟足細胞特異敲除lncRNA DLX6-os1轉基因小鼠的培育方法

有效

• 申請號: 201910839052.0
• 申請日: 2019-09-05
• 公開（公告）號: CN110547256B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 郭佳;劉章鎖;余樸;雷敏;劉勇;鄭文;楊菁;史嫣;朱宏超;馮其;路艷芳;李佳
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/686;A01K67/027
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 蔡文雅

本發明涉及腎臟足細胞特異敲除lncRNA DLX6?os1轉基因小鼠的培育方法，可有效解決在不同腎臟疾病中研究足細胞損傷的作用機制的問題，其解決的技術方案是，通過基因工程技術對前期建立的攜帶FLOX?DLX6?os1轉基因小鼠與另一種攜帶足細胞特異的NPHS2?Cre基因的轉基因小鼠進行多代的繁殖雜交，實現腎臟足細胞特異敲除lncRNA DLX6?os1轉基因小鼠的培育，本發明為明確lncRNA DLX6?os1在足細胞損傷中的作用提供了非常好的動物模型，有效解決在不同腎臟疾病中研究足細胞損傷的作用機制的問題，是轉基因小鼠的培育方法上的創新。

技術領域

本發明涉及醫學生物，特別是一種腎臟足細胞特異敲除lncRNA DLX6-os1轉基因小鼠的培育方法。

背景技術

腎臟的濾過功能對于維持機體正常的運轉至關重要，其濾過功能的維持需要濾過屏障才能發揮。而濾過屏障中最重要的組分之一就是足細胞。足細胞的健康與否關系著腎臟功能乃至整個機體功能的正常維持。疾病狀態下，如果足細胞受損，發生足細胞肥大、凋亡、或者足突融合均會導致足細胞的濾過功能下降，最直接的臨床表現就是患者出現蛋白尿，而蛋白尿的出現將會加重整個腎臟的損傷，目前已發現多種腎臟病的發生發展關鍵之一就是足細胞損傷，如糖尿病腎病、IgA腎病、狼瘡腎等。因此，維持足細胞的健康狀態是減少腎臟疾病損害的關鍵。

前期的研究基礎發現 LncRNA DLX6-AS1（DLX6 antisense RNA 1：RefSeq GeneID 285987，對應于小鼠的是Dlx6-os1）在糖尿病腎病、IgA腎病患者的腎組織中表達增多，尤其是在足細胞中的表達較正常對照組表達增多，進一步通過腎病動物模型和細胞模型進行驗證，發現 DLX6-os1的表達水平與小鼠的尿蛋白的增加成正相關，和足細胞的損傷程度成正相關，進一步實驗發現在正常足細胞中過表達lncRNA DLX6-os1可導致足細胞損傷、小鼠發生蛋白尿，說明lncRNA DLX6-os1與腎臟損傷、足細胞損傷密切相關，但具體的機制和作用不明。

為了進一步明確該lncRNA在足細胞中的重要作用，需要改變實驗動物足細胞DLX6-os1的表達水平，目前國際普遍應用的方法是注射攜帶lncRNA的病毒到相應的組織器官，試圖改變該lncRNA的表達水平，即使是使用足細胞特異表達的慢病毒載體，仍然存在較多問題：1.病毒的感染效率低，不能實現在特定細胞中有效改變lncRNA的表達水平的效果；2.有些lncRNA序列較長，不適合包裝病毒或造成病毒的滴度低，不合適感染動物；3.在特異靶細胞中的效果較差。

因此，通過基因工程技術對前期建立的攜帶FLOX-DLX6-os1轉基因小鼠進一步基因改造，發明了腎臟足細胞特異敲除lncRNA DLX6-os1轉基因小鼠（flox / flox，NPHS2-Cre）的培育方法，為明確lncRNA DLX6-os1在足細胞損傷中的作用提供了非常好的動物模型，有效解決在不同腎臟疾病中研究足細胞損傷的作用機制的問題，但至今未見有公開報道。

發明內容

針對上述情況，為解決現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種腎臟足細胞特異敲除lncRNA DLX6-os1轉基因小鼠的培育方法，可有效解決在不同腎臟疾病中研究足細胞損傷的作用機制的問題。

本發明解決的技術方案是，通過基因工程技術對前期建立的攜帶FLOX-DLX6-os1轉基因小鼠與另一種攜帶足細胞特異的NPHS2- Cre基因的轉基因小鼠進行多代的繁殖雜交，實現腎臟足細胞特異敲除lncRNA DLX6-os1轉基因小鼠（flox/flox，NPHS2- Cre）的培育，具體是：

1）基因動物打靶培育F0代：將Southern blot（印跡雜交）驗證基因為陽性的ES細胞用于基因打靶，即將基因敲除質粒載體導入ES（胚胎干細胞）細胞中，通過顯微注射到囊胚中，再移植到代孕母鼠的子宮內發育下一代，獲得攜帶FLOX-DLX6-os1的首建鼠F0代；