[發明專利]腎臟足細胞特異敲除lncRNA DLX6-os1轉基因小鼠的培育方法

有效

• 申請號: 201910839052.0
• 申請日: 2019-09-05
• 公開（公告）號: CN110547256B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 郭佳;劉章鎖;余樸;雷敏;劉勇;鄭文;楊菁;史嫣;朱宏超;馮其;路艷芳;李佳
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/686;A01K67/027
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 蔡文雅

1.一種腎臟足細胞特異敲除lncRNA DLX6-os1轉基因小鼠的培育方法，其特征在于，通過基因工程技術對前期建立的攜帶FLOX-DLX6-os1轉基因小鼠與另一種攜帶足細胞特異的NPHS2- Cre基因的轉基因小鼠進行多代的繁殖雜交，具體是：

1）基因動物打靶培育F0代：將Southern blot驗證基因為陽性的ES細胞用于基因打靶，即將基因敲除質粒載體導入ES細胞中，通過顯微注射到囊胚中，再移植到代孕母鼠的子宮內發育下一代，獲得攜帶FLOX-DLX6-os1的首建鼠F0代；

2）F1代雜合子小鼠繁殖：利用攜帶FLOX-DLX6-os1的首建鼠與野生型小鼠交配，得到新生小鼠，剪鼠尾進行PCR作為基因鑒定，確定具有flox/+基因型的小鼠作為F1代雜合子；

3）F2代組織特異性KO雜合子小鼠繁殖：將F1代雜合子小鼠與帶有NPHS2-Cre 基因型的小鼠雜交，得到新生小鼠，剪鼠尾進行PCR作為基因鑒定，確定具有flox/+，NPHS2-Cre基因型的小鼠作為F2代組織特異性KO雜合子；

4）純合子足細胞特異敲除DLX6-os1的轉基因小鼠繁殖：將F2代組織特異性KO雜合子相互交配，得到新生小鼠，剪鼠尾進行PCR作為基因鑒定，確定具有flox/flox，NPHS2-Cre基因型的小鼠作為組織特異性KO純合子，即得足細胞特異敲除DLX6-os1的轉基因小鼠。

2.根據權利要求1所述的腎臟足細胞特異敲除lncRNA DLX6-os1轉基因小鼠的培育方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

1）基因動物打靶培育F0代：

將靶向的ES細胞克隆6F4注射到C57BL/6白化胚胎中，然后將其重新植入CD-1假妊娠雌性中，通過其毛色辨別親本，用C57BL/6雌性育種并隨后對后代進行基因分型確認種系傳遞：

A、ES打靶-電轉

（1）、DMEM培養基加入15%胎牛血清，37℃，5%CO₂培養ES細胞；

（2）、胰酶消化，進行細胞計數，確定細胞量足夠電轉；

（3）、離心收集細胞，加入電轉緩沖液和線性化質粒DNA，冰浴片刻，將混合物加入電轉杯進行電轉；

（4）、電轉后冰浴片刻，接種于培養ES細胞的培養基，所述的培養基由DMEM培養基加入15%胎牛血清組成；

（5）、培養過夜，次日加藥，進行抗藥性篩選；

（6）、繼續培養，待細胞生長穩定后，挑單克隆于96孔板；

（7）、將96孔板ES細胞轉移至新的96孔板，傳代培養；

（8）、細胞生長穩定后，96孔板細胞送檢PCR，做初次打靶篩選；同時，備份板于-80℃保存；

B、ES打靶-PCR篩選：

（1）、SDS裂解液和蛋白酶K混合液裂解96孔板ES細胞，過夜裂解；

（2）、次日，用無水冰乙醇和氯化鈉混合液沉淀基因組DNA；

（3）、質量濃度70%乙醇清洗沉淀，去除殘留乙醇，加入RNAaseA和注射水混合液，封口37℃培養箱過夜，作為PCR模板；

（4）、準備96孔PCR板，進行PCR擴增及電泳檢測；

PCR引物：

5’arm-F (P1): 5’-CTACTAGCCACATGCTTCTCTTGTGAGG-3’

5’arm-R (P2): 5’-TCGAACTTGTGGCCGTTTACGTG-3’

野生型: N.A.

基因敲除: ~2.7 kb

Distal loxP PCR:

Distal-loxP-F (P3): 5’-GCCCCAAACTAGAAATCCCTCATC-3’

Distal-loxP-R (P4): 5’-TTGTATGGAGTTGACCCAAAGGGAG-3’

Wildtype: 238 bp

Targeted: 325 bp

（5）、電泳完成，記錄檢測結果；

C、ES打靶-細胞復蘇傳代：

（1）、準備細胞復蘇所需試劑及物品；

（2）、取出-80℃凍存的備份板；

（3）、將PCR陽性克隆從96孔板傳代至12孔板；

（4）、12孔板細胞生長穩定后，傳至6cm培養皿；

（5）、再將6cm培養皿細胞傳至10cm培養皿；

（6）、待細胞生長穩定后，消化，離心收集細胞，一部份凍存；一部分送檢SouthernBlot；

D、ES打靶-Southern Blot

（1）、PCR法制備地高辛標記探針；

（2）、ES細胞基因組DNA的抽提；

（3）、基因組DNA酶切，酶切產物進行電泳分離；

（4）、電泳凝膠轉膜，將凝膠上的DNA轉移至尼龍膜；

（5）、紫外交聯固定尼龍膜；

（6）、DNA預雜交；

（7）、預雜交完成后，進行雜交過夜；

（8）、雜交后，進行洗膜和阻斷；

（9）、加入抗體孵育，洗滌緩沖液洗滌后，加入檢測緩沖液平衡；

（10）、將膜放入底物顯色液中，避光顯色，使用碧云天公司顯色試劑盒顯色；

（11）、顯色完成，洗膜緩沖液洗滌，觀察結果；

E、囊胚注射：

（1）、從交配后3.5天的供體母鼠子宮內獲取囊胚；

（2）、安裝顯微注射設備，準備所需試劑及物品；

（3）、挑選形態良好、發育狀態適中的囊胚，轉移至注射皿的培養基內；

（4）、將待注射ES轉移至注射皿的細胞培養基內，使其均勻排列，密度適中；

（5）、將ES細胞吸入注射針，將其逐個注射入囊胚腔；

（6）、注射完成后，可在囊胚腔內看到ES細胞；

F、代孕鼠制備及胚胎移植：

（1）、選取適齡的母鼠與結扎公鼠合籠，獲取代孕母鼠；

（2）、將注射ES細胞的囊胚移植入代孕母鼠的子宮內；

（3）、將代孕母鼠放在干凈的籠盒中，并保溫待其清醒后放回籠架飼養；

（4）、囊胚移植完成，待嵌合體小鼠出生；

（5）、嵌合體出生1周后編號，3周后進行分籠；

2）正確打靶的F1代雜合子小鼠繁殖：

（1）、步驟1中的雄性嵌合體出生滿8周，與8周齡B6或Flp/Cre工具母鼠合籠；

（2）、出生小仔放入新的籠盒，并進行編號；

（3）、待1周齡，剪小鼠腳趾送檢PCR，進行一次鑒定；

（4）、保留一次鑒定陽性小鼠，待2周齡剪鼠尾送檢PCR，進行二次鑒定；

（5）、經2次PCR鑒定陽性的小鼠，為正確打靶的具有flox/+基因型的F1代雜合子小鼠；

3）F2代組織特異性KO雜合子小鼠繁殖：

（1）、步驟2中的F1代雜合子小鼠雜交雄性嵌合體出生滿8周，與帶有NPHS2-Cre基因型的8周齡母鼠合籠；

（2）、出生小仔放入新的籠盒，并進行編號；

（3）、待1周齡剪小鼠腳趾送檢PCR，進行一次鑒定；

（4）、保留一次鑒定陽性小鼠，待2周齡剪鼠尾送檢PCR，進行二次鑒定；

（5）、經2次PCR鑒定陽性的小鼠，為正確打靶的具有flox/+，NPHS2-Cre基因型的F2代組織特異性KO雜合子小鼠；

4）純合子足細胞特異敲除DLX6-os1的轉基因小鼠繁殖：

（1）、步驟3中的F2代組織特異性KO 雜合子小鼠出生滿8周相互交配合籠；

（2）、出生小仔放入新的籠盒，并進行編號；

（3）、待1周齡剪小鼠腳趾送檢PCR，進行一次鑒定；

（4）、保留一次鑒定陽性小鼠，待2周齡剪鼠尾送檢PCR，進行二次鑒定；

（5）、經2次PCR鑒定陽性的小鼠，確定具有flox/flox，NPHS2-Cre基因型的小鼠作為組織特異性KO 純合子，即足細胞特異敲除DLX6-os1的轉基因小鼠。