[發明專利]一種L-蘇氨酸醛縮酶及其在對甲砜基苯絲氨酸合成中的應用

有效

• 申請號: 201910838613.5
• 申請日: 2019-09-05
• 公開（公告）號: CN110577948B
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 林娟;王力超;許煉;陳承滔;賴凌燕
• 申請（專利權）人: 福建昌生生物科技發展有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 福州旭辰知識產權代理事務所(普通合伙) 35233
• 代理人: 程春寶

本發明提供一種L?蘇氨酸醛縮酶，具有將對甲砜基苯甲醛和甘氨酸不對稱催化合成(2S,3R)?對甲砜基苯絲氨酸的活性，L?蘇氨酸醛縮酶選擇自下組中任意一種：(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；(2)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列≥80％同源性的多肽；(3)將SEQ ID NO：1所示氨基酸序列經過1?5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且保留催化活性的衍生多肽。本發明還提供L?蘇氨酸醛縮酶在對甲砜基苯絲氨酸合成中的應用，挖掘篩選到來源于Actinocorallia herbida的L?蘇氨酸醛縮酶基因，采用基因工程技術表達重組大腸桿菌來源的L?蘇氨酸醛縮酶，以對甲砜基苯甲醛和甘氨酸為原料，采用全細胞催化的方法，不對稱催化合成(2S,3R)?對甲砜基苯絲氨酸，反應條件溫和、對環境友好。

技術領域

本發明屬于生物技術和化學工程領域，具體涉及一種L-蘇氨酸醛縮酶及其在對甲砜基苯絲氨酸合成中的應用。

背景技術

β-羥基-α-氨基酸是β-氨基醇類抗生素甲砜霉素和氟苯尼考、糖肽類抗生素萬古霉素、抗癌藥物紫杉醇以及免疫抑制劑的重要組成成分。對甲砜基苯絲氨酸是β-氨基醇類廣譜抗生素甲砜霉素和氟苯尼考合成的關鍵手性砌塊，具有2個手性中心，可形成4種手性異構體，目前已報道的活性中間體幾乎都是由(2S,3R)-構型組成。如何通過不對稱催化高效構建其結構中的兩個相鄰手性中心，開發甲砜霉素和氟苯尼考的高效綠色合成新路線一直是有機合成化學研究的重點與難點。

目前，工業上合成甲砜霉素和氟苯尼考手性中間體主要采用基于拆分策略的合成路線。首先以對甲砜基苯甲醛和甘氨酸為原料，在硫酸銅以及氨水的作用下，在70℃條件下經羥醛縮合反應(aldol reaction)合成對甲砜基苯絲氨酸銅鹽，并在氯化氫氣體作用下，與無水乙醇進行酯化反應得到對甲砜基苯絲氨酸乙酯，再用D-酒石酸對反應混合物進行手性拆分，得到(2S,3R)-對甲砜基苯絲氨酸乙酯，最后通過硼氫化鈣的還原獲得其對應的氨基醇。該路線在合成對甲砜基苯絲氨酸銅鹽時會產生大量的硫酸銅廢水，另外消旋體的拆分過程也會產生大量的廢水，對環境污染嚴重；而且通過拆分分離單一異構體，目標產物理論產率最高只能達到50％。

相較于化學合成法，生物催化法具有轉化條件溫和、環境友好、立體選擇性強等優點。蘇氨酸醛縮酶(EC 4.1.2.5,TA)是磷酸吡哆醛(PLP)依賴型酶，能催化不同取代基的醛與甘氨酸進行羥醛縮合反應，直接形成不對稱C-C鍵，從而得到β-羥基-α-氨基酸。根據產物在C_α的構型，可將TA分成L-TA(L-蘇氨酸醛縮酶)和D-TA(D-蘇氨酸醛縮酶)兩種，L-TA催化的產物之一便是(2S,3R)-β-羥基-α-氨基酸，參見附圖4所示。

目前國內外還未見到利用L-蘇氨酸醛縮酶催化對甲砜基苯甲醛和甘氨酸合成(2S,3R)-對甲砜基苯絲氨酸的文章報道，涉及的相關專利申請文獻只有1件：《蘇氨酸醛縮酶、突變體及其在制備取代苯絲氨酸衍生物中的應用》(申請公布號CN 109402098 A)。但該發明申請公開了幾種微生物來源的蘇氨酸醛縮酶基因和氨基酸序列、突變體編碼基因、幾種異源表達方法(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、釀酒酵母)；以及以蘇氨酸醛縮酶或蘇氨酸醛縮酶的突變體為催化劑，以2-/3-/4-位取代的苯甲醛為底物，以5-磷酸吡哆醛為輔酶，以甘氨酸/甘氨酸酯為輔底物，控制溫度和攪拌速度的條件下，在反應介質里進行酶催化，制備2-/3-/4-位取代的苯絲酸衍生物。該專利申請涉及的內容繁多，但卻缺乏具體的實驗數據支撐，2張附圖沒有標品、不同手性的對甲砜基苯絲氨酸的出峰時間和構型說明，無法判斷其ee值、de值和構型；而且該方案需要將成功重組后的大腸桿菌超聲破碎并提取純酶液作為催化劑，流程繁瑣且成本很高。

綜上所述，現在需要尋找一種β-氨基醇類抗生素手性中間體的不對稱生物催化合成方法，解決現有技術中有機合成方法所存在的生產步驟繁瑣、反應條件劇烈、生產成本高、環境污染大等技術瓶頸問題。

發明內容：