[發明專利]一種檢測DNA中的單鏈斷裂的方法

有效

• 申請號: 201910837092.1
• 申請日: 2019-09-05
• 公開（公告）號: CN110628886B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 菲利普·卡帕諾夫;曹慧芬;洛雷娜·薩拉薩爾-加西亞;高帆;徐冬旸;蔡燁;韓雪兒;王芳;唐露
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;游學明

本發明公開了一種檢測DNA中的單鏈斷裂的方法，包括如下步驟：1)對待測DNA進行片段化，由此產生的片段的3’末端不能被加尾；2)對片段化的待測DNA的3’末端進行第一次加尾；3)對第一次加尾后的樣品通過以下步驟捕獲和識別全基因組中DNA單鏈斷裂(single strand breaks,SSBs)的位置：首先，使用嵌合5’?DNA?RNA?3’引物對加尾后的片段進行線性擴增；其次，對擴增產物的3’末端進行第二次加尾；最后，目標產物通過包含接頭序列的寡核苷酸進行PCR擴增建庫并進行二代測序。4)通過測序結果確定SSBs位置。

技術領域

本發明屬于生物技術領域。旨在提供一種命名為SSiNGLe-ILM(基于Illumina測序平臺上核苷酸水平的單鏈斷裂DNA檢測)的方法，該方法可在Illumina新一代測序平臺上繪制全基因組范圍內DNA中的單鏈斷裂(single strand breaks,SSBs)，其檢測精度可達核苷酸水平。

背景技術

DNA損傷現在被普遍認為是癌癥和許多其他與衰老相關疾病的主要原因，與人類健康息息相關。DNA損傷有多種類型，其中單鏈斷裂是最為普遍的一種。這些損傷表現為氧自由基位點的DNA損傷，在切除DNA修復通路以及相關中間產物如拓撲異構酶等過程中起調節作用。SSBs引起的復制叉停滯或者崩塌可進一步惡化成更為嚴重的雙鏈斷裂(doublestrand breaks，DSBs)。另外，作為細胞中的一個主要問題，SSBs可以抑制RNA聚合酶催化的轉錄進程，甚至在一些情況下可以導致細胞凋亡。目前發現詳細的SSBs修復通路，貫穿由發現到開始修復的每個步驟，體現了DNA損傷的重要性。這些細胞通路的缺陷可導致細胞對基因毒性應急反應、胚胎致死以及一系列神經退行性疾病的敏感性增強。

對SSB修復機制的詳細步驟的需求與日俱增，然而，與之形成鮮明對比的是定位核苷酸層面上的、全局的、精確無偏的內源性SSBs方法的嚴重缺失。相比之下，一系列綜合性的用于定位DSBs的方法已經較為成熟，例如BLESS、BLISS等等(參考綜述)。據了解，目前只有一個方法可以找到對應的內源性SSBs，主要依靠SSB的3’-OH標記，引導DNA聚合酶I進行切口平移反應，用生物素化的核苷酸標記下游DNA。已標記的DNA經過純化后，直接進行二代測序。然而，這個方法的主要缺點在于反應產物是一段DNA區域，很有可能從原SSB位置中延伸出去幾千個堿基，從而無法精確地從核酸層面上鑒定損傷位置。另外一方面，胡教授等人研發了一種檢測在全基因組水平定位切除修復過程中切除產生的初級短DNA斷裂的方法，該方法能夠從核酸層面上精確地找到SSB。但是無法提供由其他機制產生的SSB的信息，因此無法綜合反映SSBs。

綜上所述，這種非常重要的DNA損傷——SSBs，其核酸水平的全基因組圖譜仍未知。在這里，我們研發并驗證了一種新方法，即SSiNGLe-ILM，它可以檢測核酸水平的SSBs。我們將這種方法應用在常用的Illumina測序平臺上。結果表明，斷裂的基因組模式——SSB“斷裂組”很可能為研究生物系統狀態提供新的研究維度，并且可作為血液生物標記物的一種新來源。

發明內容

本發明目的在于提供一種基于核苷酸水平的單鏈斷裂DNA檢測方法，該方法可以在二代測序平臺上全面地繪制全基因組范圍內DNA中的單鏈斷裂(SSB)，其檢測精度可達核苷酸水平。

本發明的技術方案如下：

一種檢測DNA中的單鏈斷裂的方法，包括如下步驟：

1)對待測DNA進行片段化，由此產生的片段的3’末端不能被加尾；

2)對片段化的待測DNA的3’末端進行第一次加尾；

3)對第一次加尾后的樣品通過以下步驟捕獲和識別全基因組中DNA單鏈斷裂(single strand breaks,SSBs)的位置：

首先，使用嵌合5’-DNA-RNA-3’引物對加尾后的片段進行線性擴增；