[發(fā)明專利]一種檢測(cè)DNA中的單鏈斷裂的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910837092.1
• 申請(qǐng)日: 2019-09-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110628886B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 菲利普·卡帕諾夫;曹慧芬;洛雷娜·薩拉薩爾-加西亞;高帆;徐冬旸;蔡燁;韓雪兒;王芳;唐露
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華僑大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 廈門(mén)市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;游學(xué)明

1.一種非疾病診斷目的的檢測(cè)DNA中的單鏈斷裂的方法，包括如下步驟：

1）對(duì)待測(cè)DNA采用微球菌核酸酶—MNase進(jìn)行片段化并產(chǎn)生3’-磷酸末端和3’-OH末端，該3’-磷酸末端不能被加尾；

2）對(duì)片段化的待測(cè)DNA的3’-OH末端進(jìn)行第一次加尾；

3）對(duì)第一次加尾后的樣品通過(guò)以下步驟捕獲和識(shí)別全基因組中DNA單鏈斷裂—SSBs的位置：

首先，使用5’-DNA-RNA-3’ 嵌合引物對(duì)加尾后的片段進(jìn)行線性擴(kuò)增；

其次，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的3’末端進(jìn)行第二次加尾；所述的第一次加尾和第二次加尾所用的堿基不互補(bǔ)；

最后， 目標(biāo)產(chǎn)物通過(guò)包含接頭序列的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增建庫(kù)并進(jìn)行二代測(cè)序；

4）通過(guò)測(cè)序結(jié)果確定SSBs位置。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非疾病診斷目的的檢測(cè)DNA中的單鏈斷裂的方法，其特征在于：步驟1）所述的片段化后的產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍為150-500堿基對(duì)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非疾病診斷目的的檢測(cè)DNA中的單鏈斷裂的方法，其特征在于：所述的5’-DNA-RNA-3’嵌合引物，能在所使用的反應(yīng)條件下退火結(jié)合至第一次加尾上。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非疾病診斷目的的檢測(cè)DNA中的單鏈斷裂的方法，其特征在于：步驟3）第二次加尾，使用dCTP加尾時(shí)長(zhǎng)度范圍為10-100堿基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非疾病診斷目的的檢測(cè)DNA中的單鏈斷裂的方法，其特征在于：所述的接頭序列為包括Illumina在內(nèi)的二代測(cè)序系統(tǒng)所用的接頭序列。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非疾病診斷目的的檢測(cè)DNA中的單鏈斷裂的方法，其特征在于：步驟4）通過(guò)序列分析確定SSBs位置，包括：

（1）篩選出符合以下要求的雙端原始序列：序列1以第二次加尾堿基互補(bǔ)和數(shù)量對(duì)應(yīng)的堿基開(kāi)頭，序列2以第一次加尾堿基互補(bǔ)和數(shù)量對(duì)應(yīng)的堿基開(kāi)頭；

（2）篩選出的序列比對(duì)待測(cè)生物體的基因數(shù)據(jù)庫(kù)；只保留序列1和序列2都能夠特異性比對(duì)到合適的結(jié)構(gòu)和間隔的成對(duì)序列；

（3）在比對(duì)出的序列中，去除其序列2中5’端前15-25bp的T堿基含量40%的成對(duì)序列，SSB位點(diǎn)被定義為序列2中引物的對(duì)應(yīng)數(shù)量堿基后的第一個(gè)堿基。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種非疾病診斷目的的檢測(cè)DNA中的單鏈斷裂的方法，其特征在于：步驟（3）中，去除其序列2中5’端前20bp的T堿基含量40%的成對(duì)序列。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種非疾病診斷目的的檢測(cè)DNA中的單鏈斷裂的方法，其特征在于：SSB位點(diǎn)被定義為序列2中12個(gè)T后的第一個(gè)堿基。

9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的一種非疾病診斷目的的檢測(cè)DNA中的單鏈斷裂的方法在雙鏈斷裂檢測(cè)的非診斷目的用途。