[發明專利]外周血單個核細胞的分離方法

在審

• 申請號: 201910836499.2
• 申請日: 2019-09-05
• 公開（公告）號: CN110551686A
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發明（設計）人: 何美弟;江嘉豪;王進輝;于莉
• 申請（專利權）人: 廣東唯泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 44100 廣州新諾專利商標事務所有限公司
• 代理人: 許英偉

本發明提供一種外周血單個核細胞的分離方法，涉及再生醫學領域。本發明的分離方法包括以下步驟：預處理：將采集的外周血進行離心，分離上層血液和下層血細胞，將下層血細胞與羥乙基淀粉溶液混合，混合均勻后放置沉降，去除沉降后的上清液，保留下層沉淀；分離：向下層沉淀中加入紅細胞裂解液，混合均勻，離心，取細胞沉淀，加入PBS重懸，將細胞懸液加入到淋巴細胞分離液中，離心，去除上清液，保留細胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合，離心，得到PBMC細胞沉淀；培養：用培養基重懸PBMC細胞沉淀，分裝至培養瓶中進行培養。采用本發明的方法，分離的外周血單個核細胞的數量多、純度高、活性高。

技術領域

本發明涉及再生醫學領域，特別是涉及一種外周血單個核細胞的分離方法及應用。

背景技術

外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)即外周血中具有單個核的細胞，主要包括淋巴細胞(T淋巴細胞和B淋巴細胞)、單核細胞、吞噬細胞、樹突狀細胞和其他少量細胞類型，這些細胞是組成機體免疫應答功能的重要細胞。近年對外周血單個核細胞的研究越來越深入，研究發現外周血單個核細胞可以在體外增殖并定向分化。相比于從骨髓抽取免疫細胞，從外周血獲取外周血單個核細胞，獲取更容易，基本人體帶來的痛苦。

2010年有研究顯示CD80聯合CD28/CpG ODN活化的PBMC對胃癌細胞殺傷作用。2014年另外一項研究從臨床和實驗方面探討宮腔灌注外周血單個核細胞對胚胎著床的影響及其機制。可見，外周血單個核細胞有望成為一種新的疾病治療手段。

目前，外周血單個核細胞的分離方法有很多種，但是制備得到的單個核細胞得率低、活性低，不利于其應用。因此，有必要開發一種新的分離外周血單個核細胞的方法，提高其分離效率和活性。

發明內容

基于此，有必要針對現有分離外周血單個核細胞的方法得率低、活性低的問題，提供一種外周血單個核細胞的分離方法。

一種外周血單個核細胞的分離方法，包括以下步驟：

預處理：將采集的外周血進行離心，分離上層血液和下層血細胞，將下層血細胞與羥乙基淀粉溶液混合，混合均勻后放置沉降，去除沉降后的上清液，保留下層沉淀；

分離：向下層沉淀中加入紅細胞裂解液，混合均勻，離心，取細胞沉淀，加入PBS重懸，將細胞懸液加入到淋巴細胞分離液中，離心，去除上清液，保留細胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合，離心，得到PBMC細胞沉淀；

培養：用培養基重懸PBMC細胞沉淀，分裝至培養瓶中進行培養。

上述分離方法，采用羥乙基淀粉溶液對血細胞進行沉降，采用紅細胞裂解液裂解紅細胞，采用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，加入肝素抑制血小板的粘附聚集，有利于去除細胞懸液中留存的血小板，加入人血白蛋白維持血液滲透壓和轉運功能，以上各步驟組合使分離得到的外周血單個核細胞數量多、活性高。

在其中一個實施例中，所述預處理步驟中：離心轉速為1700～1900rpm，離心時間為8～12min。

在其中一個實施例中，下層血細胞與羥乙基淀粉溶液的體積比為(3～5):1；沉降的時間為50～70min。

在其中一個實施例中，所述羥乙基淀粉溶液的濃度為20～40g/mL。

在其中一個實施例中，所述預處理步驟中，采集外周血時，將外周血放置于肝素鈉采血管中，采集完成后，將肝素鈉采血管放置于密封無菌運輸瓶中冷藏運輸，冷藏溫度為4～8℃。