[發(fā)明專利]外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910836499.2
• 申請日: 2019-09-05
• 公開（公告）號(hào): CN110551686A
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何美弟;江嘉豪;王進(jìn)輝;于莉
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東唯泰生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/078
• 分類號(hào): C12N5/078
• 代理公司: 44100 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 許英偉

1.一種外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法，其特征在于，包括以下步驟：

預(yù)處理：將采集的外周血進(jìn)行離心，分離上層血液和下層血細(xì)胞，將下層血細(xì)胞與羥乙基淀粉溶液混合，混合均勻后放置沉降，去除沉降后的上清液，保留下層沉淀；

分離：向下層沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液，混合均勻，離心，取細(xì)胞沉淀，加入PBS重懸，將細(xì)胞懸液加入到淋巴細(xì)胞分離液中，離心，去除上清液，保留細(xì)胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合，離心，得到PBMC細(xì)胞沉淀；

培養(yǎng)：用培養(yǎng)基重懸PBMC細(xì)胞沉淀，分裝至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法，其特征在于，所述預(yù)處理步驟中：離心轉(zhuǎn)速為1700～1900rpm，離心時(shí)間為8～12min。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法，其特征在于，下層血細(xì)胞與羥乙基淀粉溶液的體積比為(3～5):1；沉降時(shí)間為50～70min。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法，其特征在于，所述羥乙基淀粉溶液的濃度為20～40g/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法，其特征在于，所述預(yù)處理步驟中，采集外周血時(shí)，將外周血放置于肝素鈉采血管中，采集完成后，將肝素鈉采血管放置于密封無菌運(yùn)輸瓶中冷藏運(yùn)輸，冷藏溫度為4～8℃。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法，其特征在于，所述分離步驟具體為：向下層沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液，紅細(xì)胞裂解液與下層沉淀的體積比為(0.8～1.2):1，混合均勻后放置于4±1℃下保存2～4min，離心，離心轉(zhuǎn)速為1700～1900rpm，離心時(shí)間為8～12min，取細(xì)胞沉淀，加入PBS重懸，將細(xì)胞懸液加入到淋巴細(xì)胞分離液中，離心，離心轉(zhuǎn)速為600～1000rpm，離心18～22min，去除上清液，保留細(xì)胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合均勻后置于4±1℃下保存2～4min，離心，離心轉(zhuǎn)速為1700～1900rpm，離心時(shí)間為8～12min，得到PBMC細(xì)胞沉淀。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法，其特征在于，所述肝素的工作濃度為0.2～1U/mL，人血白蛋白的工作濃度為10～30g/mL。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法，其特征在于，所述淋巴細(xì)胞分離液為Ficoll淋巴細(xì)胞分離液。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法，其特征在于，細(xì)胞懸液與Ficoll淋巴細(xì)胞分離液的體積比為5:(2～4)。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法，其特征在于，所述培養(yǎng)步驟中，培養(yǎng)瓶為75cm²的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)環(huán)境中，濕度為飽和濕度，溫度為37±0.5℃，CO₂濃度為5.0％±0.5％。