[發明專利]一種誘導化橘紅愈傷組織出芽的方法

有效

• 申請號: 201910830033.1
• 申請日: 2019-09-02
• 公開（公告）號: CN110521596B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 黃新敏;韓寒冰;歐陽樂軍;李小雙;林玨;彭召敏
• 申請（專利權）人: 廣東石油化工學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 深圳市鼎泰正和知識產權代理事務所(普通合伙) 44555
• 代理人: 繆太清

本發明屬于植物組培技術領域，具體涉及一種化橘紅愈傷組織誘導出芽的方法；它包括以下步驟：外植體選取以及滅菌、愈傷組織形成、繼代培養、誘導愈傷組織出芽和芽形成后的生根誘導、煉苗和移栽；通過在誘導化橘紅莖段芽位形成愈傷組織的基礎上，在原有愈傷組織形成培養基配方的基礎上采用海藻糖代替蔗糖并加入化橘紅葉提取液和乙酰丁香酮制成誘導愈傷組織出芽專用培養基，該方法可通過海藻糖及乙酰丁香酮的出芽誘導能力以及化橘紅葉提取液的抗氧化及抑菌能力在愈傷組織的基礎上誘導愈傷形成大量芽并發育為獨立植株，實現化橘紅的組培苗的大批量生產。

技術領域

本發明屬于植物組培技術領域，具體涉及一種化橘紅愈傷組織誘導出芽的方法。

背景技術

化橘紅具有散寒燥濕，利氣消疾，止咳、健脾消食等功效，有“南方人參”之稱，是我國著名的南藥之一，也是十大廣藥之一，2006年被列入國家地理標志產品保護。地道化橘紅是由蕓香科植物化州柚的未成熟果實的外果皮加工而成。化橘紅繁殖技術多采用嫁接及高枝壓條等方式，這極大限制了化橘紅優良品種的推廣。因此采用組織培養技術對化橘紅優良品種進行擴繁具有重要的優勢。目前已有化橘紅組織培養技術的研究，但均需要挑選特定時間的帶芽莖段作為外植體直接進行芽誘導，不能形成愈傷組織，培養出芽少，需要消耗大量的外植體，因此較難實現組培苗的大批量生產。此外化橘紅外植體培養過程中會形成大量的酚類物質，造成愈傷組織褐化，進而抑制愈傷分化出芽。

發明內容

本發明目的是通過在誘導化橘紅莖段芽位形成愈傷組織的基礎上，在原有愈傷組織形成培養基配方的基礎上采用海藻糖代替蔗糖并并加入化橘紅葉提取液和乙酰丁香酮制成誘導愈傷組織出芽專用培養基，該方法可通過海藻糖及乙酰丁香酮的出芽誘導能力以及化橘紅葉提取液的抗氧化和抑菌能力在愈傷組織的基礎上誘導愈傷形成大量芽并發育為獨立植株，實現化橘紅的組培苗的大批量生產。

本發明的技術方案為：

一種化橘紅愈傷組織誘導出芽的方法，它包括以下步驟：外植體選取以及滅菌、愈傷組織形成、繼代培養、誘導愈傷組織出芽和芽形成后的生根誘導、煉苗和移栽；

其中愈傷組織形成步驟采用愈傷組織形成培養基；

愈傷組織形成培養基的配制：MS+芐基腺嘌呤(6-BA)0.8-1.2mg/L+萘乙酸(NAA)

0.03-0.06mg/L+維生素C 100～120mg/L+蔗糖50g/L+土豆100g/L+瓊脂7g/L，培養基pH值為5.8；其中誘導愈傷組織出芽步驟采用誘導培養基；

誘導培養基的配制：MS+芐基腺嘌呤(6-BA)0.8-1.2mg/L+萘乙酸(NAA)0.03-0.06mg/L+維生素C 100～120mg/L+乙酰丁香酮0.196mg/L+15g/L海藻糖+化橘紅葉提取液0.02％(也就是0.2mg/L)+土豆100g/L+瓊脂7g/L，培養基pH值為5.8。

其中化橘紅提取液制備方法：

取新鮮化橘紅葉置110℃烘箱中殺青，再置60℃中烘至恒重，經粉碎和過40目篩得到小于40目的粉末作提取用。分別取5g葉樣品粉末，置于250mL提取管中，加入60％乙醇溶液250mL，充分搖勻，采用超聲儀在40～50℃超聲20～30min，提取2次。合并所有提取液并冷凍干燥，用超純水進行溶解并置4℃備用。

其中，所述愈傷組織形成步驟中，在溫度為26±2℃的條件下暗培養15～20天。

其中，所述誘導愈傷組織出芽步驟中，在光照強度為2300-2400lx，16h/8h光暗條件下(16小時光照培養、8小時暗培養，光暗培養交替循環進行)，溫度為26±2℃的條件下培養25～35天。

其中，所述外植體采用化橘紅當年生半木質化莖段。

進一步地，所述化橘紅當年生半木質化莖段用滅菌手術刀斜切1.5-2.0cm的腋芽作為外植體。