[發明專利]一種大腦皮層神經干細胞及谷氨酸能神經元的制備方法

有效

• 申請號: 201910828104.4
• 申請日: 2019-09-03
• 公開（公告）號: CN110760476B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 張凌;何翠敏
• 申請（專利權）人: 廣州瑞臻再生醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;C12N5/0797
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 宋靜娜;郝傳鑫

本發明提供了一種大腦皮層神經干細胞及谷氨酸能神經元的制備方法，涉及一種iPSC完全神經誘導培養液，包括以下組分：細胞基礎培養液、細胞培養添加劑、神經發育因子和抑制劑。本發明提供一種iPSC完全神經誘導培養液和神經細胞培養液以及培養方法。培養液中包括無血清基礎培養基、細胞添加劑、神經發育因子和抑制劑。其中，利用物血清基礎培養基可以避免引入外源性物質，降低污染風險，同時，多種營養成分，如細胞添加劑和神經發育因子，能夠使iPSC細胞受到信號刺激，活化iPSC細胞，促進分化。本發明提供的細胞培養方法，簡單高效、成本低、短周期內可誘導獲得高質量的神經元細胞。

技術領域

本發明屬于細胞分化技術領域，具體涉及一種大腦皮層神經干細胞及谷氨酸能神經元的制備方法。

背景技術

自2007年山中伸彌及其團隊建立了第一個人的誘導多能干細胞系(hiPSC)已達十二年之久，但是由于對控制其分化的分子機制知之甚少，這些細胞的實際應用非常有限，具體而言，從多功能hiPSC到神經外胚層細胞的分化步驟(也稱為神經誘導)人們知之甚少。

到目前為止，由于目前人們對神經誘導的機制仍然不甚明了，因此由胚胎干細胞定向和完全的分化為神經組織從而反應胚胎發生過程尚未實現。來自hiPSC的神經細胞的產生完全基于經驗方法，例如類胚體形成，使用化學物小分子或外源基因過表達，與鼠基質細胞共培養，和hiPSC過度培養生長以獲得自發分化的神經細胞。在干細胞研究領域中，眾所周知這些方法是不充分的，耗費時間(用小鼠基質細胞進行的神經誘導可達4周時間)，并且產生異質細胞群，包括中胚層，內胚層和胚胎外胚層，難以獲得高純度的功能性神經干細胞及神經細胞用于臨床細胞治療。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術的不足之處而提供一種大腦皮層神經干細胞及谷氨酸能神經元的制備方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

一方面本發明提供了一種iPSC完全神經誘導培養液，包括以下組分：細胞基礎培養液、細胞培養添加劑、神經發育因子和抑制劑。

優選地，所述細胞基礎培養液為DMEM/F12和NeuroBasal。

優選地，所述細胞培養添加劑為B27、NEAA、Glutamax或N2中的一種或其任意組合；其中B27的濃度為0.5×～2×、NEAA的濃度為0.5×～2×、Glutamax的濃度為0.5×～2×；N2的濃度為0.5×～2×。

本發明中的B27為購自Thermo Fisher公司貨號為17504044，商品名為B-27^TMSupplement(50×)serum free的商品；NEAA為購自Thermo Fisher公司貨號為11140050，商品名為MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100×)的商品；Glutamax為購自Thermo Fisher公司貨號為35050061，商品名為GlutaMAX^TM Supplement(100×)的商品；N2為購自Thermo Fisher公司貨號為17502001，商品名為N-2Supplement(100×)的商品。其中“50×”、“100×”表示商品試劑的濃度倍數，本發明中50×的B27表示濃度為50倍，100×的NEAA、Glutamax、N2分別表示濃度為100倍，因此，在本發明中使用上述試劑時以其濃度倍數計算。例如：濃度為0.5×的B27表示將濃度倍數為50×的B27商品稀釋至終濃度倍數為0.5；濃度為2×的B27表示將濃度倍數為50×的B27商品稀釋至終濃度倍數為2，依次類推。