[發明專利]一種大腦皮層神經干細胞及谷氨酸能神經元的制備方法

有效

• 申請號: 201910828104.4
• 申請日: 2019-09-03
• 公開（公告）號: CN110760476B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 張凌;何翠敏
• 申請（專利權）人: 廣州瑞臻再生醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;C12N5/0797
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 宋靜娜;郝傳鑫

1.一種iPSC神經細胞培養液，其特征在于，包括以下組分：細胞基礎培養液、細胞培養添加劑、神經營養因子和表皮生長因子，所述細胞添加劑為B27、NEAA、Glutamax和N2的組合物，其中B27的濃度為0.5×～2×、NEAA的濃度為0.5×～2×、Glutamax的濃度為0.5×～2×、N2的濃度為0.5×～2×，其中“×”表示濃度倍數；所述神經營養因子為BDNF、GDNF和IGF1的組合，其中BDNF的濃度為10ng/ml～100ng/ml、GDNF的濃度為10ng/ml～100ng/ml、IGF1的濃度為10ng/ml～100ng/ml；所述表皮生長因子的濃度為5ng/ml～100ng/ml。

2.如權利要求1所述的iPSC神經細胞培養液，其特征在于，所述細胞基礎培養液為NeuroBasal。

3.一種大腦皮層神經干細胞及谷氨酸能神經元的制備方法，包括以下步驟：

(1)培養人類誘導多能干細胞(iPSC)，細胞每7天使用ReLeSR進行傳代；

(2)準備用于神經誘導的iPSC：制備iPSC單細胞，在經過聚合物基質預處理的培養板孔中加入單細胞懸浮液，使細胞均勻分布，5％CO₂的濕潤環境下37℃培養；

(3)神經干細胞誘導：室溫預熱iPSC完全神經誘導培養液，所述iPSC完全神經誘導培養液包括以下組分：細胞基礎培養液、細胞培養添加劑、神經發育因子和抑制劑，所述細胞培養添加劑為B27、NEAA、Glutamax和N2的組合物；其中B27的濃度為0.5×～2×、NEAA的濃度為0.5×～2×、Glutamax的濃度為0.5×～2×；N2的濃度為0.5×～2×，其中“×”表示濃度倍數；所述神經發育因子為中期因子、多效生長因子和胰島素樣生長因子-1的組合；其中中期因子的濃度為40～150ng/ml；多效生長因子的濃度為40～120ng/ml；胰島素樣生長因子-1的濃度為20～100ng ml；所述抑制劑為RepSox、SB431542、dorsomorphin、KY02111和DKK1的組合；其中RepSox的濃度為2nM～5μM；SB431542的濃度為40nM～4μM；dorsomorphin的濃度為20nM～4μM；KY02111的濃度為100nM～80μM；DKK1的濃度為1μg/ml～40μg/ml；

第一天在iPSC細胞密度為70％時，吸除舊的前期培養液，并向培養板中每個孔加入預熱的iPSC完全神經誘導培養液，放回37℃，5％CO₂的濕潤環境中培養；

第二到六天，用無菌的移液管吸除舊的iPSC完全神經誘導培養液，加入新的預熱的iPSC完全神經誘導培養液，放回培養箱中培養；

第七天，取適量細胞做免疫熒光染色檢測NPC的標志物的表達以確定NPC的濃度；

(4)神經元分化：在經過聚合物基質預處理的培養板孔中加入如權利要求1所述的神經細胞培養液，將獲得的NPC單細胞懸浮液加入培養板孔中，使細胞均勻分布，5％CO₂的濕潤環境下37℃培養，最后對神經元細胞進行鑒定。