[發明專利]用于大腸桿菌O157:H7血清型致病菌檢測的試劑、試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201910822892.6
• 申請日: 2019-09-02
• 公開（公告）號: CN110387429B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 薛峰;陳詩勝;戴建君;陳偉;蔣原;曾德新;任建鸞;湯芳;余曉峰
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 南京利豐知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32256
• 代理人: 趙世發

本發明公開了一種用于大腸桿菌O157:H7血清型致病菌檢測的試劑、試劑盒及應用。所述檢測試劑包括：主要由第一引物和第二引物組成的引物對，所述第一引物和第二引物的序列分別如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。本發明通過G?四鏈體核酸擬酶催化底物氧化還原反應產生的顏色變化，能夠以肉眼直接同時判斷待測樣品中是否含有大腸桿菌O157:H7，提高了檢測食源性致病菌的靈敏度，使用G?四鏈體核酸擬酶通過引入酶循環信號放大及PCR產物放大雙重策略實現最終信號的放大，從而實現對大腸桿菌O157:H7的可視化檢測。

技術領域

本發明特別涉及一種用于大腸桿菌O157:H7血清型致病菌檢測的試劑、試劑盒及應用，屬于分子生物學方法的檢測技術領域。

背景技術

食源性病原微生物引起的公共衛生問題是世界上的一大難題，其漏檢率高達95％以上。根據WHO估計，全球每年因食源性微生物感染性腹瀉導致的死亡人口不少于200萬人，其中大部分是由于飲食和飲水受到了微生物的污染，腸出血性大腸桿菌(EHEC)在食源性病原微生物污染中占有重要的衛生學地位。

EHEC大腸桿菌O157:H7主要長期存在于家畜家禽的腸道中，世界范圍內的人類均有發病報道。大腸桿菌O157:H7感染能引起出血性結腸炎(Hemorrhagic colitis,HC)，闌尾炎，食管狹窄和結腸穿孔等嚴重胃腸道并發癥，在兒童和老年人中還可引起溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板減少性紫癜(ThromboticThrombocytopenic purpura,TTP)等嚴重并發癥，重者可引起死亡。據估計，美國每年大腸桿菌O157:H7暴發感染超過73,500人，在1999年江蘇、安徽等地爆發了食源性污染大腸桿菌衛生事件，導致199人死亡，大腸桿菌O157:H7的感染具有暴發流行趨勢、強烈的致病性與致死性以及抗生素治療可能會加劇病情，導致這種病原體不僅成為一個重要的食品安全問題，而且是一個嚴重的醫療和公共衛生問題。

核酸擬酶是核酸的過氧化物酶樣復合物，其通常為單鏈的DNA/RNA，核酸擬酶可以折疊成穩定和催化活性的G-四鏈體，在氯化血紅素存在下與之結合可以催化一些化學反應產生顏色變化，可用于裸眼檢測，將核酸擬酶結合傳統PCR不僅可以避免核酸染料的污染，降低對實驗器材的要求，簡化傳統PCR檢測的操作步驟，提高檢測方法的靈敏度，重要的是使檢測肉眼可見也可以結合其他儀器進行定量的檢測。

大腸桿菌O157:H7的檢測通常使用傳統的選擇性培養基或變色瓊脂。然而該方法的主要局限性在于數天的培養周期才能提供關于菌株性質或分離自身的準確信息，PCR已廣泛用于檢測來自食品和環境樣品的大腸桿菌O157:H7，最近，實時PCR因其增強的靈敏度和特異性以及快速的周轉時間而越來越受歡迎，現有檢測大腸桿菌O157:H7的熒光定量方法，檢測靈敏度達到80CFU/ml，但是使用的熒光定量PCR儀價值昂貴，使用成本高，在基層仍然不能滿足監控的要求。傳統的PCR儀需結合凝膠電泳的方法分析條帶的大小和亮度來判斷，不僅檢測的靈敏度不及熒光定量PCR，且存在凝膠電泳操作步驟繁瑣和實驗室核酸染料的污染問題。隨著傳統PCR技術的普及以及便攜儀器的開發，使得田間檢測成為可能，但是凝膠電泳來觀察結果費時費力且有一定的生物危害對實驗操作者要求高，因此亟需一種基于傳統PCR的便攜、快速、靈敏、安全、可視化的檢測方法，以及時有效地應對未來的爆發，必須有足夠的敏感，特異和可靠的方法，用于快速便捷的檢測大腸桿菌O157:H7。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種能夠更加靈敏、快速便捷、可視化的用于大腸桿菌O157:H7血清型致病菌早期檢測的核酸擬酶比色試劑、試劑盒及應用，以克服現有技術中的不足。

為實現前述發明目的，本發明采用的技術方案包括：

本發明實施例一方提供了一種檢測試劑，其包括：主要由第一引物和第二引物組成的引物對，所述第一引物和第二引物的序列分別如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。