[發明專利]用于大腸桿菌O157:H7血清型致病菌檢測的試劑、試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201910822892.6
• 申請日: 2019-09-02
• 公開（公告）號: CN110387429B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 薛峰;陳詩勝;戴建君;陳偉;蔣原;曾德新;任建鸞;湯芳;余曉峰
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 南京利豐知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32256
• 代理人: 趙世發

1.一種檢測試劑，其特征在于包括：主要由第一引物和第二引物組成的引物對、氯化血紅素溶液、氯化鉀溶液、HEPES 緩沖溶液、顯色A液、顯色B液、終止液、DNA聚合酶、PCR常規組件、二甲基亞嵐、L-半胱氨酸鹽酸鹽、檸檬酸、濃硫酸、亞硫酸鈉、甘油、過氧化氫、乙酸鈉和EDTA二鈉鹽，

所述第一引物和第二引物的序列分別如SEQ ID NO：1 、SEQ ID NO：2所示，所述第一引物、第二引物的5’端具有串聯重復鳥嘌呤(G)且能形成核酸擬酶的互補序列；

所述HEPES 緩沖溶液包含25 m M Hepes、 20 m M KCl、200 m M NaCl、0.025% (w/v)Triton X-100、1% (v/v) DMSO，所述HEPES 緩沖溶液的pH為7.4；

所述顯色A液包含乙酸鈉、檸檬酸、亞硫酸鈉和過氧化氫，所述顯色B液包含EDTA二鈉鹽、檸檬酸、甘油、L-半胱氨酸鹽酸鹽和TMB。

2.一種試劑盒，其特征在于包括權利要求1所述的檢測試劑。

3.一種應用于大腸桿菌O157:H7血清型致病菌檢測方法的產品，其特征在于：所述產品包括權利要求1所述檢測試劑或權利要求2所述試劑盒，并且，所述檢測方法包括：

利用所述引物對，通過PCR擴增反應對從待測樣品內提取到的核酸進行擴增；

將PCR擴增后的產物與氯化血紅素溶液、氯化鉀溶液、HEPES 緩沖溶液混合形成第一混合體系，加熱解鏈后恒溫孵育；

將孵育后的第一混合體系與所述顯色A液和顯色B液混合形成第二混合體系，并通過觀察第二混合體系的顏色或檢測第二混合體系的OD值實現對待測樣品內大腸桿菌O157:H7血清型致病菌的定性或定量檢測。

4.根據權利要求3所述的產品，其特征在于：所述PCR擴增反應的反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，擴增30個循環，充分延伸72℃10min。

5.根據權利要求3所述的產品，其特征在于，所述檢測方法包括：將所述第一混合體系于95℃左右條件下加熱解鏈，之后快速降溫至4℃以下孵育。