[發明專利]卡氏住白細胞蟲重組R7蛋白及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201910822274.1
• 申請日: 2019-09-02
• 公開（公告）號: CN110684097A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 鄺春曼;譚志堅;黃儀娟;劉麗丹;翁亞彪;王新秋
• 申請（專利權）人: 佛山市正典生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/44
• 分類號: C07K14/44;C12N15/70;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 44205 廣州嘉權專利商標事務所有限公司
• 代理人: 左恒峰

1.一種卡氏住白細胞蟲重組R7蛋白，其特征在于，所述卡氏住白細胞蟲重組R7蛋白具有的氨基酸序列為MBP-R7。

2.權利要求1所述的卡氏住白細胞蟲重組R7蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將卡氏住白細胞蟲R7基因進行PCR擴增，得到卡氏住白細胞蟲重組R7基因；

(2)用限制性內切酶對psYNO-1質粒進行酶切，將卡氏住白細胞蟲重組R7基因與酶切后psYNO-1質粒用連接酶連接，并轉化到E.coli TOP10感受態細胞中培養，再進行PCR鑒定陽性克隆，得到PCR鑒定陽性菌液，提取PCR鑒定陽性菌液質粒，經雙酶切鑒定得到陽性重組質粒psYNO-R7；

(3)將陽性重組質粒psYNO-R7轉化到E.coli BL21表達菌，加入異丙基硫代半乳糖苷進行誘導表達，得到psYNO-R7重組蛋白；

(4)將誘導表達后的psYNO-R7重組蛋白純化，得到卡氏住白細胞蟲重組R7蛋白。

3.根據權利要求2所述的卡氏住白細胞蟲重組R7蛋白的制備方法，其特征在于，所述卡氏住白細胞蟲重組R7基因的制備方法包括以下步驟：

(1)找到卡氏住白細胞蟲R7核苷酸序列，進行密碼子優化后再合成R7基因序列；

(2)設計一對特異性連接引物的核苷酸序列為：CTGTACTTCCAGGGAGCAAGTGGTCTGGTTACC和GTGGTGGTGCTCGAGTTATCACACTTCTTCATGT，再設計一對鑒定引物的核苷酸序列為GACTAATTCGAGCTCGAACAACAACA和CATGTTCTTCTTTTTCTTTCTCTTCGTG；

(3)以合成的R7基因為模板，PCR擴增R7基因片段，得到卡氏住白細胞蟲重組R7基因。

4.根據權利要求3所述的卡氏住白細胞蟲重組R7蛋白的制備方法，其特征在于，所述特異性連接引物的5’端含有與表達質粒載體psYNO-1末端同源的15個堿基和3’端含有R7基因特異引物序列。

5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述限制性內切酶為BamHⅠ和XhoⅠ。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述雙酶切鑒定的步驟為：將psYNO-R7、SacⅠ、XhoⅠ、10×M Buffer和ddH₂O加入到滅菌的1.5mL離心管中混勻，在37℃下恒溫水浴2h，得到酶切產物，將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，將鑒定為陽性的質粒做好標記，并測序，得到陽性重組質粒psYNO-R7，保存于-20℃中。

7.權利要求1所述卡氏住白細胞蟲重組R7蛋白在檢測卡氏住白細胞蟲病中的應用。