[發明專利]用于檢測小鼠腺病毒K87株的PCR引物、PCR方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201910814534.0
• 申請日: 2019-08-30
• 公開（公告）號: CN110358868B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 王立鵬;朱明星;時長軍
• 申請（專利權）人: 蘇州西山生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 胡昌國

本申請屬于病原微生物的檢測領域，涉及用于檢測小鼠腺病毒K87的PCR引物、PCR方法及試劑盒；具體地，本申請提供了一對針對小鼠腺病毒K87株特異性好、靈敏度高的檢測引物、熒光定量PCR方法和檢測試劑盒。所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示序列；所述PCR方法至少包括根據小鼠腺病毒K87株六鄰體蛋白基因，通過Primer Premier 5設計獲得所述上游引物和下游引物；所述試劑盒至少提供所述上游引物和下游引物，或者采用所述PCR方法。

技術領域

本申請屬于病原微生物的檢測領域，涉及小鼠腺病毒K87株的檢測，尤其涉及用于檢測小鼠腺病毒K87株的PCR引物、檢測方法和該檢測方法的應用。具體地，本申請提供了一對針對小鼠腺病毒K87株特異性好、靈敏度高的檢測引物、熒光定量PCR方法和檢測試劑盒。

背景技術

小鼠腺病毒(Murine adenovirus，MAdV)屬于腺病毒科哺乳動物腺病毒屬，無包膜，是一種雙鏈DNA的病毒。小鼠是小鼠腺病毒的自然宿主，該病毒在小鼠群體中多呈陰性感染，也可能引起致死疾病，其中實驗小鼠主要通過糞便和尿液接觸感染并傳播。在20世紀60年代從小鼠體內分離該病毒，已被確認分類地位的株型有兩種血清型：I型FL株(MAdV-1)與II型K87株(MAdV-2)。小鼠多數是感染FL株，一般表現為弓背、被毛粗糙、食欲下降等癥狀，新生乳鼠可致死。FL株感染可引發小鼠全身性感染，病毒侵入棕色脂肪、心肌、腎上腺、唾液腺、腎等處，對裸鼠的致病性較強。而II型K87株感染通常對新生乳鼠和成年鼠不發病，其造成腸道局部感染，經糞便不斷向外排毒。2009年Boris Klempa等從黑線鼠肝懸浮液中分離出一種新的小鼠腺病毒，并獲得完整的基因組序列，經比對，與小鼠腺病毒I型相似最高，但同時發現該病毒的多個基因組區域與小鼠腺病毒I型存在明顯差異，被定義為小鼠腺病毒III型(MAdV-3)，新型MAdV-3在遺傳性、血清上以及感染小鼠的趨向性上與MAdV-1不同，主要感染動物心臟組織。

小鼠腺病毒是無特定病原體動物SPF級小鼠要求檢測項目之一。中國藥典對鼠源性生物制品要求檢測8種病毒，其中包括MAdV。而現有文獻中小鼠腺病毒的鑒定方法常見的有血清檢測學及PCR方法。國家標準規定的MAdV檢測方法也屬于血清學檢測方法，但血清學方法存在假陽性問題，且不易診斷出早期感染等。

隨著分子生物學的快速發展，分子檢測技術也越來越被重視與應用。其中熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)因其快速、簡便、特異度強、靈敏度高等諸多優點在病原體檢測領域得到廣泛應用。2014年王吉等針對E1B基因建立了建立小鼠腺病毒(MAdV)的RT-PCR檢測方法，應用于長爪沙鼠、小鼠等實驗動物MAdV的檢測，其中能檢測小鼠腺病毒DNA最小模板濃度為1.67pg/μl，但該方法需要根據電泳后目的條帶位置判定結果。2017年杜江濤等建立的針對MADV-3的PCR方法對質粒DNA最低檢測限為4.5copies/反應，可用于大鼠、小鼠、長爪沙鼠等實驗動物組織、糞便及鼠源性生物制品MAdV的檢測。但是，目前還沒有關于針對MAdV-2的特異性熒光定量PCR方法的報道。

雖然專利文獻中存在用于檢測小鼠腺病毒的PCR方法，申請人為舒泰神(北京)生物制藥股份有限公司的專利申請CN102329890A和CN102399907A均涉及小鼠腺病毒的PCR方法，均是針對MAdV-1。廣東省實驗動物監測所申請公布號CN106566897A的專利，同樣檢測的小鼠腺病毒為MAdV-1。而浙江省醫學科學院申請公布號為CN105861751A的專利，建立的是MAdV-3的PCR方法。尚未檢索到用于檢測MAdV-2的PCR方法。