[發(fā)明專利]一種富含核黃素的發(fā)酵型豆?jié){的生產(chǎn)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910813169.1
• 申請(qǐng)日: 2019-08-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110463769A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 甘人友;葛穎穎;張家榮;高海德
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): A23C11/10
• 分類號(hào): A23C11/10;C12N1/20;C12N1/02;C12N15/01;C12R1/25
• 代理公司: 31220 上海旭誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 鄭立<國(guó)際申請(qǐng)>=<國(guó)際公布>=<進(jìn)入國(guó)

1.一種富含核黃素的發(fā)酵型豆?jié){的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：從商業(yè)泡菜汁中篩選野生型高產(chǎn)核黃素乳酸菌

1.1泡菜汁梯度稀釋后分別接種到核黃素分析型固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，隨后，從所述核黃素分析型固體培養(yǎng)基上獲得的菌落中挑選出完整、光滑、顆粒較大且長(zhǎng)勢(shì)最好的90個(gè)核黃素生產(chǎn)乳酸菌單菌落，并將所述90個(gè)核黃素生產(chǎn)乳酸菌單菌落分別接種到核黃素分析型液體培養(yǎng)基上，并多次培養(yǎng)；

1.2對(duì)步驟1.1得到的經(jīng)多次培養(yǎng)的所述90個(gè)核黃素生產(chǎn)乳酸菌單菌落產(chǎn)核黃素的含量進(jìn)行HPLC測(cè)定，根據(jù)HPLC所測(cè)得的核黃素含量，篩選出核黃素生產(chǎn)能力最強(qiáng)的一株野生菌，鑒定并命名為植物乳桿菌RYG-YYG-9049，配制成保存液進(jìn)行保存；

步驟2：篩選出核黃素最高產(chǎn)突變菌株

2.1稱取一定量玫瑰黃色素溶解于二甲基亞砜(DMSO)中得到玫瑰黃色素DMSO溶液，并將所述玫瑰黃色素DMSO溶液以1.0mL/管分裝于1.5mL的離心管中，避光保存待用；

2.2將4.0mL避光保存的所述玫瑰黃色素DMSO溶液加入200mL核黃素分析型培養(yǎng)基溶液中，混合均勻后制作平板培養(yǎng)基，即為含有100mg/L玫瑰黃色素的核黃素分析型固體培養(yǎng)基；

2.3在不加入瓊脂的前提下，按照步驟2.2的方法，依次制作濃度為10mg/L、50mg/L以及200mg/L的玫瑰黃色素核黃素分析型液體培養(yǎng)基；

2.4取100μL所述植物乳桿菌RYG-YYG-9049的保存液加入到1.9mL的核黃素分析型液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫厭氧罐中活化培養(yǎng)12小時(shí)得到菌株活化培養(yǎng)液，隨后，取100μL上述第一次培養(yǎng)后的所述菌株活化培養(yǎng)液按上述方法重復(fù)活化2次得到最終菌株活化培養(yǎng)液；

2.5取步驟2.4得到的所述最終菌株活化培養(yǎng)液100μL，接種到所述含有100mg/L玫瑰黃色素的核黃素分析型固體培養(yǎng)基中，于37℃下恒溫培養(yǎng)2-4天；

2.6從接種有所述最終菌株活化培養(yǎng)液的所述100mg/L玫瑰黃色素的核黃素分析型固體培養(yǎng)基上獲得的菌落中挑選10個(gè)完整、光滑、顆粒較大且長(zhǎng)勢(shì)最好的突變菌株單菌落，并挑取每個(gè)所述突變菌株單菌落分別接種至2.0mL含有10mg/L玫瑰黃色素的核黃素分析型液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)；

在所述含有10mg/L玫瑰黃色素的核黃素分析型液體培養(yǎng)基中取10個(gè)所述突變菌培養(yǎng)液各100μL，分別加入到1.9mL所述含有50mg/L玫瑰黃色素的的核黃素分析型液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)；

在所述含有50mg/L玫瑰黃色素的的核黃素分析型液體培養(yǎng)基中取10個(gè)所述突變菌培養(yǎng)液各100μL，分別加入到1.9mL所述含有100mg/L玫瑰黃色素的的核黃素分析型液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)；

在所述含有100mg/L玫瑰黃色素的的核黃素分析型液體培養(yǎng)基中取10個(gè)所述突變菌培養(yǎng)液各100μL，分別加入到1.9mL所述含有200mg/L玫瑰黃色素的的核黃素分析型液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)；

2.7在所述含有200mg/L玫瑰黃色素的的核黃素分析型液體培養(yǎng)基中取10個(gè)所述突變菌培養(yǎng)液各100μL分別接種到MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，將每個(gè)MRS固體培養(yǎng)基上獲得的所述突變菌單菌落分別接種于2.0mL核黃素分析型液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并測(cè)定其相對(duì)應(yīng)的核黃素含量；

2.8根據(jù)HPLC的核黃素含量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所述植物乳桿菌RYG-YYG-9049的10號(hào)突變菌，命名為植物乳桿菌RYG-YYG-9049-M10，其核黃素生產(chǎn)能力最強(qiáng)，大約為其原始野生菌株的2倍，將所述植物乳桿菌RYG-YYG-9049-M10配制成保存液進(jìn)行保存；

步驟3：熟豆?jié){的制備、接種發(fā)酵

3.1挑選顆粒完整、飽滿、有光澤、無(wú)霉變的大豆，用純凈水清洗三次，并在室溫下于純凈水中浸泡，浸泡后將所述大豆瀝干，于豆?jié){機(jī)中進(jìn)行研磨得到生豆?jié){，所述生豆?jié){經(jīng)篩子去除豆渣，過(guò)濾后的所述生豆?jié){于4℃下靜置2小時(shí)后，在100℃下加熱30分鐘，得到熟豆?jié){，隨后于室溫下自然冷卻；

3.2將步驟2.8得到的所述植物乳桿菌RYG-YYG-9049-M10接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃下進(jìn)行恒溫活化培養(yǎng)，待接種后的所述MRS液體培養(yǎng)液于600nm下的吸光度值達(dá)到0.2時(shí)，于室溫下10000rpm離心30秒，將上清液倒掉，回收得到的所述植物乳桿菌RYG-YYG-9049-M10，用生理鹽水沖洗三次，隨后重新懸浮于生理鹽水中，并用生理鹽水稀釋至OD₆₀₀為0.2，得到活化的所述植物乳桿菌RYG-YYG-9049-M10；

3.3將活化的所述植物乳桿菌RYG-YYG-9049-M10接種至所述熟豆?jié){中進(jìn)行發(fā)酵，接種后的豆?jié){于37℃下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為20小時(shí)，即可得到富含核黃素的發(fā)酵型豆?jié){。