[發(fā)明專利]一種鯽造血器官壞死癥酵母口服疫苗及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910811945.4
• 申請日: 2019-08-30
• 公開（公告）號: CN110564750B
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周勇;薛明洋;范玉頂;劉文枝;江南;孟彥;李逸群;曾令兵;聶細(xì)榮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N1/19;C07K19/00;A61K39/245;A61P31/22;C12R1/865
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物疾病免疫領(lǐng)域，具體公開了一種鯽造血器官壞死癥酵母口服疫苗及應(yīng)用，所述的口服疫苗是表達(dá)有融合蛋白LTB?ORF25釀酒酵母，所述融合蛋白LTB?ORF25（1+3）的氨基酸序列為SEQ ID NO.13所示。該蛋白的免疫原性好，在鯽魚體內(nèi)的穩(wěn)定性好，疫苗保護(hù)力高，攻毒后鯽魚的存活率達(dá)到了86.67%，制成口服疫苗后，操作簡單，適合大規(guī)模推廣。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物疾病免疫領(lǐng)域，具體涉及一種鯽造血器官壞死癥酵母口服疫苗及應(yīng)用。

背景技術(shù)

鯉皰疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,CyHV-2)感染異育銀鯽是近年新出現(xiàn)的一種嚴(yán)重病毒性疾病，已經(jīng)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。鯉皰疹病毒Ⅱ型最早在觀賞金魚中發(fā)現(xiàn)，稱為“金魚皰疹病毒性造血器官壞死癥”。該病毒因其是第二個分離自鯉科魚的皰疹病毒，國際病毒系統(tǒng)分類與命名委員會將其命名為鯉皰疹病毒II型(CyHV-2)。CyHV-2與鯉痘瘡病毒(Ca rp pox herpesvirus,Cyprinid herpesvirus Ⅰ,CyHV-1)及錦鯉皰疹病毒(Koiherpesvirus,Cy prinid herpesvirus3,CyHV-3)的關(guān)系接近，屬于鯉皰疹病毒科成員，目前CyHV-2的全基因組測序與注釋研究已經(jīng)完成，對CyHV-2重要功能基因的研究正陸續(xù)展開，但對病毒疫苗制備方面研究相對較少。

CyHV-2(SY-C1株,GenBank Access.No.KM200722.1)基因組由289 365個堿基對組成，開放閱讀框約(Open Reading Frame,ORF)151個，這151個ORF編碼了構(gòu)成病毒自身所有的結(jié)構(gòu)和功能蛋白(Li et al.,2015)。其中，CyHV-2ORF25屬于ORF25多基因家族，編碼膜蛋白，含有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，具有較好的免疫原性。申請人前期對ORF25編碼蛋白的跨膜特性分析發(fā)現(xiàn)，ORF25蛋白跨膜特性與大多數(shù)已知的皰疹病毒吸附蛋白(gC蛋白)的跨膜特性一致，即僅在蛋白C端存在一個跨膜結(jié)構(gòu)域(未發(fā)表數(shù)據(jù))，是制備預(yù)防鯽魚皰疹病毒病疫苗的重要靶基因。

大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-liable enterotoxin，LT)是由腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(enterot oxigenet ic E.coli，ETEC)分泌的一種外毒素,具有很強(qiáng)的免疫原性。LT分子是由1個A亞基(28ku)和5個完全相同的B亞基(11.5ku)單體組成的AB5型六聚體蛋白。A亞基具有ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性，是LT的毒素活性部分。B亞基在空間上形成環(huán)狀五聚體，包含有神經(jīng)節(jié)甘脂(mono sialoganglio side，GM)結(jié)合位點，是LT的受體結(jié)合部位。無毒的B亞基(LTB)具有良好的免疫原性，是一種很好的免疫佐劑。Weltzin等將重組LTB作為佐劑與尿素酶共同免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生特異性的血清抗尿素酶IgG1和IgG2a以及唾液中的抗尿素酶IgA，以及對Hp的保護(hù)性免疫。Rask等將重組LTB作為佐劑與人丙種球蛋白(HGG)共同免疫后，發(fā)現(xiàn)LTB可提高抗原的粘膜免疫原性，還能介導(dǎo)針對它的體液和粘膜B細(xì)胞和T細(xì)胞的長期記憶反應(yīng)。Jobling等利用LTB基因與肺炎鏈球菌表面蛋白A(PSPA)的基因融合表達(dá)了具有免疫活性的重組蛋白。J.Rombout等將LTB與犬細(xì)小病毒VP2蛋白以及綠色熒光標(biāo)記蛋白在土豆中表達(dá)，將轉(zhuǎn)基因土豆通過干燥粉碎等過程制備成飼料投喂鯉魚，通過熒光顯微鏡觀察以及ELISA檢測法可以檢測到表達(dá)的融合蛋白在腸道被魚體吸收，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。

酵母表面展示(Yeast surface display)技術(shù)是繼噬菌體展示技術(shù)發(fā)明以來的一種展示異源蛋白的真核展示系統(tǒng)，酵母細(xì)胞對異源蛋白表達(dá)后將其運送至細(xì)胞外并利用二硫鍵將目的蛋白錨定于酵母細(xì)胞表面，使其結(jié)構(gòu)更加接近病毒表面的天然糖蛋白。由于抗原糖蛋白展示于酵母細(xì)胞表面，利用其進(jìn)行免疫時更加容易被免疫系統(tǒng)所識別，并且釀酒酵母(Sacchar omyces cerevisiae)細(xì)胞是食品/生物安全級的真核微生物，不但能夠?qū)ν庠吹鞍走M(jìn)行簡單的翻譯后加工修飾，而且酵母本身也是很好的免疫佐劑成分，這些優(yōu)勢使該系統(tǒng)成為口服疫苗研發(fā)的熱門工具。