[發(fā)明專利]一種創(chuàng)制高香型矮牽牛新種質(zhì)的分子方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910811769.4
• 申請(qǐng)日: 2019-08-30
• 公開（公告）號(hào): CN110452918B
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁媛;何弦;張?jiān)?/a>;伍炳華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/60
• 分類號(hào): C12N15/60;C12N15/82;C12N15/66;A01H5/02;A01H6/82
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學(xué)俊

本發(fā)明的目的在于提供一種創(chuàng)制高香型矮牽牛的分子方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)方法：本發(fā)明的目的在于提供一種創(chuàng)制高香型矮牽牛新種質(zhì)的分子方法。該方法以遺傳轉(zhuǎn)化的手段，能夠特異性地在矮牽牛花瓣中獲得香氣合成酶基因的高度表達(dá)，包括啟動(dòng)子的合成、香氣合成酶TPS（Terpene synthase）基因的擴(kuò)增，表達(dá)載體構(gòu)建。同時(shí)通過遺傳操作導(dǎo)入矮牽牛植物，獲得香氣顯著增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。其特征在于，人工合成花特異性啟動(dòng)子，以其啟動(dòng)可以合成茉莉花香型的關(guān)鍵合成酶基因TPS在矮牽牛花朵中表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)進(jìn)因植株在香氣含量上與對(duì)照相比存在明顯提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種創(chuàng)制高香型矮牽牛新種質(zhì)的分子技術(shù)。

背景技術(shù)

香氣是園藝植物的重要園藝性狀，它不僅能賦予觀賞植物特定的氣味特征，決定其經(jīng)濟(jì)和園林應(yīng)用價(jià)值，在吸引傳粉昆蟲，保護(hù)作物免受生物和非生物脅迫，介導(dǎo)植物-植物之間的通訊等方面同樣具有重要作用，對(duì)植物生存及繁衍至關(guān)重要。基于香氣的重要作用，利用分子育種手段創(chuàng)新香型種質(zhì)是園藝作物育種工作的重要方面。

茉莉花是著名的芳香植物和香料作物，其香氣清香怡人、沁人心脾，更有由其窨制的 “茉莉花茶”享譽(yù)全國(guó)，足見其香味的獨(dú)特之處。具有花香的矮牽牛現(xiàn)代雜交品種（Petunia hybrida）基本上是P. axillaris的后代，它們的花香揮發(fā)性成分是苯環(huán)類化合物，來(lái)源于苯丙氨酸代謝途徑。將茉莉花特色香氣合成關(guān)鍵基因通過花特異性啟動(dòng)子在矮牽牛花器官中特異的表達(dá)，可以獲得新/高香型種質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種創(chuàng)制高香型矮牽牛新種質(zhì)的分子方法。該方法以遺傳轉(zhuǎn)化的手段，能夠特異性地在矮牽牛花瓣中獲得香氣合成酶基因的高度表達(dá)，包括啟動(dòng)子的合成、香氣合成酶TPS（Terpene synthase）基因的擴(kuò)增，表達(dá)載體構(gòu)建。同時(shí)通過遺傳操作導(dǎo)入矮牽牛植物，獲得香氣顯著增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。其特征在于，人工合成花特異性啟動(dòng)子，以其啟動(dòng)可以合成茉莉花香型的關(guān)鍵合成酶基因TPS在矮牽牛花朵中表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)進(jìn)因植株在香氣含量上與對(duì)照相比存在明顯提高。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

1、構(gòu)建pK7FWG2.0- proCbLIS:JsTPS4表達(dá)載體

（1）合成花特異性啟動(dòng)子序列。

構(gòu)建委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成花特異性啟動(dòng)子proCbLIS核苷酸序列（GeneBank 登錄號(hào)AF067601.1）。

（2）構(gòu)建pK7FWG2.0- proCbLIS空載體。

采用酶切連接的方法，將花特異性啟動(dòng)子proCbLIS通過單向限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Spe I和Sac I置換掉表達(dá)載體pK7FWG2.0的CaMV35S啟動(dòng)子，獲得重構(gòu)的pK7FWG2.0-proCbLIS表達(dá)載體。

（3）擴(kuò)增茉莉花香氣合成關(guān)鍵酶基因JsTPS4編碼序列。

提取茉莉花花瓣總RNA，采用RACE（SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit，Clontech Laboratories, Inc.）試劑盒擴(kuò)增得到JsTPS4的5’和3’cDNA序列，拼接后獲得cDNA全長(zhǎng)，并獲得其編碼序列。

（4）構(gòu)建pK7FWG2.0- proCbLIS:JsTPS4表達(dá)載體