[發(fā)明專利]一種基于特異性靶標(biāo)鑒定單增李斯特菌血清型的多重PCR方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910804288.0
• 申請(qǐng)日: 2019-08-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110423833B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳萍;葉燕銳;林章凜;才藝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍;江裕強(qiáng)

1.一種基于特異性靶標(biāo)鑒定單增李斯特菌血清型的多重PCR方法，所述方法用于非疾病診斷目的食品樣品或細(xì)菌菌株中單增李斯特菌的血清型分型，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將待檢測(cè)的食品樣品或細(xì)菌菌株樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，得到增菌培養(yǎng)液；

(2)使用試劑盒法提取步驟(1)所述增菌培養(yǎng)液的基因組DNA，得到待鑒定的DNA提取液；

(3)將步驟(2)所述待鑒定的DNA提取液、鑒定單增李斯特菌血清型的PCR引物與PCR反應(yīng)物混合均勻，得到PCR反應(yīng)體系，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物，所述鑒定單增李斯特菌血清型的PCR引物包括PCR引物lmo2644、PCR引物L(fēng)MOf2365_0118、PCR引物lmo1119及PCR引物lmo0733，所述PCR引物lmo2644包括正向引物lmo2644-F和反向引物lmo2644-R，所述正向引物lmo2644-F如SEQ?ID?NO:1所示，所述反向引物lmo2644-R如SEQ?ID?NO:2所示；所述PCR引物L(fēng)MOf2365_0118包括正向引物L(fēng)MOf2365_0118-F和反向引物L(fēng)MOf2365_0118-R，所述正向引物L(fēng)MOf2365_0118-F如SEQ?ID?NO:3所示，所述反向引物L(fēng)MOf2365_0118-R如SEQID?NO:4所示；所述PCR引物lmo1119包括正向引物lmo1119-F和反向引物lmo1119-R，所述正向引物lmo1119-F如SEQ?ID?NO:5所示，所述反向引物lmo1119-R如SEQ?ID?NO:6所示；所述PCR引物lmo0733包括正向引物lmo0733-F和反向引物lmo0733-R，所述正向引物lmo0733-F如SEQ?ID?NO:7所示，所述反向引物lmo0733-R如SEQ?ID?NO:8所示；

(4)將步驟(3)所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到電泳結(jié)果圖，如果所述電泳結(jié)果圖上出現(xiàn)669bp和500bp條帶，則判定步驟(1)待檢測(cè)的樣品中單增李斯特菌的血清群為IIa，其血清型為1/2a或3a；若只出現(xiàn)500bp的條帶，則判定為血清群IIb，即血清型1/2b、3b或7；若只出現(xiàn)669bp、243bp和500bp的條帶，則判定為血清群IIc，即血清型1/2c或3c；若只出現(xiàn)889bp和500bp的條帶，則判定為血清群IVb，即血清型4b、4d或4e；若只出現(xiàn)669bp、889bp和500bp的條帶，則判定為血清群L，即血清型4a或4c；如果所述電泳結(jié)果圖上沒(méi)有出現(xiàn)以上條帶，則步驟(1)待檢測(cè)的樣品中不含有單增李斯特菌，判斷為單增李斯特菌陰性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于特異性靶標(biāo)鑒定單增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步驟(1)所述增菌培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為T(mén)SB培養(yǎng)基，所述增菌培養(yǎng)是在搖床中振蕩培養(yǎng)，所述增菌培養(yǎng)的溫度為36～38℃，所述增菌培養(yǎng)的時(shí)間為8～12h，所述增菌培養(yǎng)的搖床轉(zhuǎn)速為210～230rpm。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于特異性靶標(biāo)鑒定單增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步驟(2)所述待鑒定的DNA提取液中的DNA濃度為10-500ng/μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于特異性靶標(biāo)鑒定單增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步驟(3)所述PCR反應(yīng)體系，按體積份數(shù)計(jì)，包含：

其中，所述10×PCR反應(yīng)緩沖液的pH值為8.2～8.4；所述dNTP溶液為dATP、dGTP、dTTP和dCTP這四種脫氧核糖核苷三磷酸等比例與水混合均勻得到的溶液，所述dNTP溶液中四種脫氧核糖核苷三磷酸的濃度均為10～15mM；所述鑒定單增李斯特菌血清型的PCR引物溶液為鑒定單增李斯特菌血清型的PCR引物與水混合均勻得到的溶液，所述鑒定單增李斯特菌血清型的PCR引物溶液中引物的濃度為各8～12μM；所述Taq酶溶液為T(mén)aq酶與水混合均勻得到的溶液，所述Taq酶溶液的濃度為2～3U/μL；所述水為無(wú)菌且無(wú)核苷酸的超純水。