[發(fā)明專利]一種基于特異性靶標(biāo)鑒定單增李斯特菌血清型的多重PCR方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910804288.0
• 申請日: 2019-08-28
• 公開（公告）號: CN110423833B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳萍;葉燕銳;林章凜;才藝
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍;江裕強

本發(fā)明公開了一種基于特異性靶標(biāo)鑒定單增李斯特菌血清型的多重PCR方法。該方法包括：將待測單增李斯特菌菌株進(jìn)行增菌培養(yǎng)，得到增菌培養(yǎng)液；提取增菌培養(yǎng)液的DNA，將DNA提取液、PCR引物與PCR反應(yīng)物混合均勻，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；將PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳，根據(jù)電泳結(jié)果判斷待檢測菌的血清型。本發(fā)明針對新挖掘到的單增李斯特菌血清型的特異性靶標(biāo)lmo2644、LMOf2365_0118、lmo1119、lmo0733基因設(shè)計特異性引物，并建立單增李斯特菌血清型的PCR鑒定方法。這些靶標(biāo)具有準(zhǔn)確度高和特異性好的特點。該方法具有準(zhǔn)確度高、特異性好、鑒定速度快、成本低廉及操作簡單的特點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉一種基于特異性靶標(biāo)鑒定單增李斯特菌血清型的多重PCR方法。

背景技術(shù)

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria?monocytogenes,LM)簡稱單增李斯特菌，是一種人畜共患的食源性致病菌。單增李斯特菌廣泛存在于自然界中，會導(dǎo)致許多食品中的污染，并可承受食品加工過程中常見的環(huán)境壓力。單增李斯特菌抗鹽堿、耐冷，在20％的鹽濃度下仍可存活，在4℃下仍可生長繁殖。單增李斯特菌是引起李斯特菌病的唯一人類病原體，主要感染老年人、孕婦、兒童和免疫功能低下者。李斯特菌病的臨床表現(xiàn)包括腦膜炎、腦炎、流產(chǎn)、發(fā)熱性胃腸炎和敗血癥等，李斯特菌病的死亡率高達(dá)30％。因此，大多數(shù)國家都對食品中的單增李斯特菌進(jìn)行嚴(yán)格控制，特別是在即食食品中。

根據(jù)菌體和鞭毛抗原的血清型反應(yīng)，單增李斯特菌可被分為13個血清型，分別為1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e和7型。其中，1/2a、1/2b、1/2c、4b這4種血清型是主要的血清型，99％的人類李斯特菌病由這四種血清型的菌株引起。1/2a血清型是食品中最為常見的血清型，但李斯特菌病的暴發(fā)性流行大多是由4b血清型的菌株引起的，這說明4b血清型可能具有更強的毒力。以上13種血清型可進(jìn)一步被分為5個血清群(serogroup)，1/2a和3a型屬于IIa群，1/2b、3b和7型屬于IIb群，1/2c和3c型屬于IIc群，4b、4d和4e型屬于IVb群，4a和4c型屬于L群。對單增李斯特菌的血清型鑒定，在其流行株的監(jiān)測、食品安全性評估及暴發(fā)疫情的病原學(xué)溯源中具有重要的應(yīng)用價值。

目前，對單增李斯特菌血清型的鑒定方法主要是血清型方法(可見出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN-T?2521-2010)，此種方法需要使用菌毛抗原和菌體抗原，成本較高，操作復(fù)雜，易發(fā)生交叉反應(yīng)，且鑒定周期較長，完成一次鑒定需要3天以上的時間。

現(xiàn)有專利中，單增李斯特菌血清型的PCR鑒定方法，如CN?107746890?A、CN103602739?A等專利中使用的靶標(biāo)使用Primer-BLAST進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)仍缺少準(zhǔn)確度和特異性都較好的單增李斯特菌血清型PCR鑒定引物；然而，目前對單增李斯特菌血清型的新PCR鑒定靶標(biāo)的挖掘的相關(guān)文獻(xiàn)報道較少。對其新PCR鑒定靶標(biāo)的挖掘和新的PCR鑒定方法的建立，有助于提高單增李斯特菌血清型PCR鑒定的準(zhǔn)確度和特異性。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于特異性靶標(biāo)鑒定單增李斯特菌血清型的多重PCR方法。

本發(fā)明的目的至少通過如下技術(shù)方案之一實現(xiàn)。

本發(fā)明提供的一種基于特異性靶標(biāo)鑒定單增李斯特菌血清型的多重PCR方法，是一種特異性好、鑒定速度快、成本低廉、操作簡單的單增李斯特菌的PCR鑒定方法。

本發(fā)明提供的一種基于特異性靶標(biāo)鑒定單增李斯特菌血清型的多重PCR方法，該PCR方法使用的血清群IIa、IIc、L特異性靶標(biāo)基因為lmo2644，血清群IVb、L特異性靶標(biāo)基因為LMOf2365_0118、血清群IIc的特異性靶標(biāo)基因為lmo1119、單增李斯特菌特異性靶標(biāo)基因lmo0733。