[發明專利]肽酰基精氨酸脫亞胺酶(PAD)的測活法

有效

• 申請號: 201910801766.2
• 申請日: 2019-08-28
• 公開（公告）號: CN110426514B
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發明（設計）人: 來棽棽;姚曉暉;謝志偉;嚴俊
• 申請（專利權）人: 蘇州新格諾康生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了肽酰基精氨酸脫亞胺酶（PAD）的測活法，包括試劑，所述試劑包括鏈霉親和素，FBNA?2肽的水溶液，PAD酶樣品，胰蛋白酶，潤洗液，PAD緩沖液，胰蛋白酶緩沖液，HRP標記的抗6xHIS抗體，四甲基聯苯胺（TMB）底物溶液，2M硫酸，所述鏈霉親和素包被8孔條板，所述FBNA?2肽的水溶液為0.5mg/ml，所述胰蛋白酶，10mg/ml溶解于低酸度儲存液中；本發明結合了第一部分中列舉的幾乎所有當前PAD測活方法的優勢，尤其是免疫分析法的高靈敏度，易操作性，與胰蛋白酶法的低成本優勢，除了方案設計中的底物，其它所有試劑均為生物實驗室常用試劑，因而很容易獲取。

技術領域

本發明屬于技術領域，具體涉及肽酰基精氨酸脫亞胺酶（PAD）的測活法。

背景技術

肽酰基精氨酸脫亞胺酶(Peptidylarginine?deiminases，PADs)是一類依賴于Ca²⁺而催化肽酰基精氨酸轉化為肽酰基瓜氨酸的酶，該家族在人類細胞中由5個同工酶組成，PAD1-4和PAD6，PAD的酶活力通常是以底物的轉化作為讀出而進行測定的。

現有的PAD測活方法具備著一定的問題，例如比色分析法只可對純化的PAD蛋白進行快速酶活力測定，HPLC熒光分析法繁瑣耗時，不適宜同時檢測多份樣品，PAD免疫分析法獲得特異抗體成本高，具有靈敏度低，操作性差，成本高等問題，為此我們提出肽酰基精氨酸脫亞胺酶（PAD）的測活法。

發明內容

本發明的目的在于提供肽酰基精氨酸脫亞胺酶（PAD）的測活法，以解決上述背景技術中提出的現有的PAD測活方法具有靈敏度低，操作性差，成本高等問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：肽酰基精氨酸脫亞胺酶（PAD）的測活法，包括試劑，所述試劑包括鏈霉親和素，FBNA-2肽的水溶液，PAD酶樣品，胰蛋白酶，潤洗液，PAD緩沖液，胰蛋白酶緩沖液，HRP標記的抗6xHIS抗體，四甲基聯苯胺（TMB）底物溶液，2M硫酸。

進一步的，所述鏈霉親和素包被8孔條板，所述FBNA-2肽的水溶液為0.5mg/ml。

進一步的，所述FBNA-2肽的分子序列為:?Biotin-GGSGG?SYSAQ?FTSST?SYNRGDSTFE?SHHHH?HH。

進一步的，所述胰蛋白酶，10mg/ml溶解于低酸度儲存液中。

進一步的，所述潤洗液，1x?TBS?(25mM?Tris，150mM?NaCl，pH?7.2)，0.1%?BSA和0.05%?Tween-20。

進一步的，所述PAD緩沖液，0.1M?Tris-HCl?(pH?7.4)，10mM?CaCl₂，使用前加入0.5mM?DTT及1mM?PMSF，所述胰蛋白酶緩沖液，50mM?Tris-HCl?(pH?8.0)，2.5mM?EDTA。

進一步的，所述測活步驟包括：

S1：用潤洗液稀釋FBNA-2肽至0.5?ug/ml作為包被液；

S2：在ELISA板架中安裝8孔條板，潤洗條板3次后將板倒置于潔凈吸水紙上并拍干；

S3：往每孔中加入100ul包被液，室溫下孵育1小時；

S4：棄去條板中的溶液，用潤洗液潤洗4次后將板倒置于潔凈吸水紙上并拍干；

S5：用PAD緩沖液將酶稀釋至所需濃度，加入50ul至每孔中，將條板置于37℃孵育30分鐘；

S6：重復步驟S4；

S7：每孔中加入100ul胰蛋白酶緩沖液，平衡后棄去溶液；

S8：將胰蛋白酶以緩沖液稀釋1000倍后，加100ul至條板的每個反應孔中，置于37℃孵育1小時；