[發(fā)明專利]肽酰基精氨酸脫亞胺酶(PAD)的測活法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910801766.2
• 申請日: 2019-08-28
• 公開（公告）號: CN110426514B
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發(fā)明（設計）人: 來棽棽;姚曉暉;謝志偉;嚴俊
• 申請（專利權）人: 蘇州新格諾康生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.肽酰基精氨酸脫亞胺酶PAD的測活法，包括試劑，其特征在于：所述試劑包括鏈霉親和素，F(xiàn)BNA-2肽的水溶液，PAD酶樣品，胰蛋白酶，潤洗液，PAD緩沖液，胰蛋白酶緩沖液，HRP標記的抗6xHIS抗體，四甲基聯(lián)苯胺TMB底物溶液，2M硫酸；

所述鏈霉親和素包被8孔條板，所述FBNA-2肽的水溶液為0.5mg/ml；

所述FBNA-2肽的分子序列為：Biotin-GGSGG?SYSAQ?FTSST?SYNRG?DSTFE?SHHHH?HH；

所述胰蛋白酶，10mg/ml溶解于低酸度儲存液中；

所述潤洗液，由25mM?Tris、150mM?NaCl配制的pH7.2的1x?TBS，0.1%?BSA和0.05%Tween-20；

所述PAD緩沖液，0.1M?pH7.4的Tris-HCl，10mM?CaCl₂，使用前加入0.5mM?DTT及1mMPMSF，所述胰蛋白酶緩沖液，50mM?pH8.0的Tris-HCl，2.5mM?EDTA；

所述測活步驟包括：

S1：用潤洗液稀釋FBNA-2肽至0.5?ug/ml作為包被液；

S2：在ELISA板架中安裝8孔條板，潤洗條板3次后將板倒置于潔凈吸水紙上并拍干；

S3：往每孔中加入100ul包被液，室溫下孵育1小時；

S4：棄去條板中的溶液，用潤洗液潤洗4次后將板倒置于潔凈吸水紙上并拍干；

S5：用PAD緩沖液將酶稀釋至所需濃度，加入50ul至每孔中，將條板置于37℃孵育30分鐘；

S6：重復步驟S4；

S7：每孔中加入100ul胰蛋白酶緩沖液，平衡后棄去溶液；

S8：將胰蛋白酶以緩沖液稀釋1000倍后，加100ul至條板的每個反應孔中，置于37℃孵育1小時；

S9：重復步驟S4；

S10：將HIS檢測抗體以潤洗液稀釋10倍后，加100ul至條板的每個反應孔中，置于室溫孵育1小時；

S11：重復步驟S4；

S12：將TMB溶液平衡至室溫后，加100ul至條板的每個反應孔中，置于室溫，避光環(huán)境中孵育20分鐘；

S13：加50ul?2M硫酸至反應孔以終止顯色反應，輕微震動條板，此時溶液顏色由藍色轉變?yōu)辄S色，在30分鐘內于450nm和540nm分別讀取每孔的吸光度。