[發(fā)明專利]主客體探針結(jié)合納米孔技術(shù)聯(lián)用的酶活性濃度檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910798363.7
• 申請(qǐng)日: 2019-08-27
• 公開（公告）號(hào): CN110607349A
• 公開（公告）日: 2019-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳海臣;郭秉元
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院化學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/37
• 分類號(hào): C12Q1/37;G01N27/26;C12N15/11
• 代理公司: 11619 北京辰權(quán)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 董李欣

本發(fā)明涉及一種主客體探針結(jié)合納米孔技術(shù)聯(lián)用的酶活性濃度檢測(cè)方法，本發(fā)明首先提供了一種用于檢測(cè)酶活性濃度的分子組合，包括DNA?肽分子和葫蘆脲，所述DNA?肽分子由雙鏈DNA分子和肽分子組成，肽分子的羧基端共價(jià)連接于雙鏈DNA分子的5’端或3’端；所述DNA?肽分子經(jīng)待測(cè)酶作用后，改變氨基端芳香族氨基酸的暴露狀態(tài)。當(dāng)待測(cè)酶通過酶促反應(yīng)將部分肽鏈切除后，暴露出(或丟失掉)的芳香族氨基酸能夠(不能)與葫蘆脲發(fā)生主客體作用而形成(無法形成)DNA主客體探針。這種DNA主客體探針穿越納米孔時(shí)將產(chǎn)生特征電流信號(hào)，通過檢測(cè)電流信號(hào)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)酶活性濃度的高靈敏度、特異性檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及超分子化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種主客體探針結(jié)合納米孔技術(shù)聯(lián)用的酶活性濃度檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

蛋白酶作為一類重要的生物標(biāo)志物，對(duì)其活性的快速靈敏檢測(cè)不僅對(duì)于腫瘤早期診斷意義重大，同時(shí)也是療效觀察、腫瘤分期判斷及預(yù)后的重要手段。熒光光譜法是目前最為普遍的酶活性濃度檢測(cè)技術(shù)。盡管熒光法具有很高的靈敏度與較好的空間分辨率，但熒光探針通常需要復(fù)雜的設(shè)計(jì)并且自體熒光現(xiàn)象所產(chǎn)生的背景干擾將導(dǎo)致信噪比下降進(jìn)而影響方法的靈敏度及成像質(zhì)量。近些年隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，相繼開發(fā)出各種基于納米材料以實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高選擇性檢測(cè)酶活性濃度的方法。但仍需要借助大型儀器且過程繁瑣。因此發(fā)展簡(jiǎn)單、高效的酶活性濃度檢測(cè)方法變得愈發(fā)迫切。

由于DNA具有豐富多樣的“工具箱”性質(zhì)，并且堿基上或鏈末端上可進(jìn)行多種修飾等優(yōu)勢(shì)而可以被設(shè)計(jì)成各種功能不同的納米機(jī)器。2019年，Ricci等人利用修飾了花菁染料的DNA納米機(jī)器實(shí)現(xiàn)了對(duì)脲酶的高靈敏度快速檢測(cè)。但由于該方法依賴于光學(xué)信號(hào)，因此存在著光漂白、熒光壽命短、背景干擾高等問題，尤其是背景干擾極易得出假陽性結(jié)論。因此研究開發(fā)出基于DNA分子探針的高靈敏度、高選擇性、低背景干擾的酶活性濃度檢測(cè)方法對(duì)于腫瘤的早期診斷及治療、預(yù)后有著重要意義。

納米孔單通道技術(shù)是自二十世紀(jì)九十年代中期起在電生理學(xué)研究的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新興檢測(cè)手段。所謂納米孔就是孔徑尺寸在納米尺度的孔道，通常為1-100納米。當(dāng)兩個(gè)充滿電解液的相互絕緣的隔室通過納米級(jí)孔道連通，在外加電場(chǎng)作用下，溶液中的電解質(zhì)離子定向遷移并穿過納米孔從而產(chǎn)生電流，經(jīng)膜片鉗系統(tǒng)測(cè)量、放大和轉(zhuǎn)換后被記錄。當(dāng)溶液中存在待檢測(cè)物質(zhì)時(shí)，該物質(zhì)在擴(kuò)散作用或電壓驅(qū)動(dòng)下穿越納米孔，此時(shí)孔道內(nèi)通過的離子數(shù)目由于待測(cè)物的占據(jù)而產(chǎn)生變化，從而導(dǎo)致記錄到的電流發(fā)生改變，電流信號(hào)包含兩個(gè)特征量：電流阻滯振幅(amplitude)和電流阻滯時(shí)間(dwell time)，從中可以分析得出豐富的物性信息：物質(zhì)的種類、結(jié)構(gòu)、構(gòu)象變化和分子組成等。

通常情況下，生物型納米孔的靈敏度和信噪比要比人造材料納米孔好得多，因此生物納米孔更有利于實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)。但是生物納米孔是通過質(zhì)粒表達(dá)得來的，其幾何尺寸已經(jīng)固定，因此只有大小與其匹配的分子才可以穿越。而蛋白酶的尺度通常在十納米左右，因此無法穿越αHL納米孔。2011年JACS發(fā)表了基于核酸適體結(jié)合αHL納米孔檢測(cè)可卡因的工作。當(dāng)核酸適體結(jié)合可卡因后會(huì)形成Y型復(fù)合結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)無法穿越納米孔而發(fā)生長時(shí)間電流堵塞，也正是利用了這種堵塞電流信號(hào)實(shí)現(xiàn)了可卡因快速檢測(cè)。但是堵塞信號(hào)非常不利于高靈敏度檢測(cè)，因?yàn)槠湫盘?hào)特征性低，背景干擾較強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種主客體探針結(jié)合納米孔技術(shù)聯(lián)用的酶活性濃度檢測(cè)方法。

為此，本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于檢測(cè)酶活性濃度的分子組合，所述分子組合包括DNA-肽分子和葫蘆脲；

所述DNA-肽分子由雙鏈DNA分子和肽分子組成，所述肽分子的羧基端共價(jià)連接于所述雙鏈DNA分子的5’端或3’端；

所述DNA-肽分子經(jīng)待測(cè)酶作用后，改變氨基端芳香族氨基酸的暴露狀態(tài)；