[發明專利]主客體探針結合納米孔技術聯用的酶活性濃度檢測方法

在審

• 申請號: 201910798363.7
• 申請日: 2019-08-27
• 公開（公告）號: CN110607349A
• 公開（公告）日: 2019-12-24
• 發明（設計）人: 吳海臣;郭秉元
• 申請（專利權）人: 中國科學院化學研究所
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;G01N27/26;C12N15/11
• 代理公司: 11619 北京辰權知識產權代理有限公司
• 代理人: 董李欣

1.一種用于檢測酶活性濃度的分子組合，其特征在于，所述分子組合包括DNA-肽分子和葫蘆脲；

所述DNA-肽分子由雙鏈DNA分子和肽分子組成，所述肽分子的羧基端共價連接于所述雙鏈DNA分子的5’端或3’端；

所述DNA-肽分子經待測酶作用后，改變氨基端芳香族氨基酸的暴露狀態；

所述改變氨基端芳香族氨基酸的暴露狀態為：(i)所述DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸，經待測酶作用后的DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸；或，(ii)所述DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸，經待測酶作用后的DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸；

所述DNA-肽分子和葫蘆脲的摩爾比為1:10-250。

2.如權利要求1所述的分子組合，其特征在于，所述雙鏈DNA分子的長度為20-60bp。

3.如權利要求1所述的分子組合，其特征在于，所述芳香族氨基酸為苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸。

4.如權利要求1所述的分子組合，其特征在于，所述經待測酶作用后的DNA-肽分子中的氨基酸數目小于等于20。

5.如權利要求1所述的分子組合，其特征在于，所述葫蘆脲選自下組：葫蘆[6]脲，葫蘆[7]脲，葫蘆[8]脲。

6.一種用于檢測酶活性濃度的主客體探針，其特征在于，由DNA-肽分子和葫蘆脲共孵育形成；

所述DNA-肽分子由雙鏈DNA分子和肽分子組成，所述肽分子的羧基端共價連接于所述雙鏈DNA分子的5’端或3’端；

所述DNA-肽分子經待測酶作用后，改變氨基端芳香族氨基酸的暴露狀態；

所述改變氨基端芳香族氨基酸的暴露狀態為：(i)所述DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸，經待測酶作用后的DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸；或，(ii)所述DNA-肽分子的氨基端具有暴露的芳香族氨基酸，經待測酶作用后的DNA-肽分子的氨基端不具有暴露的芳香族氨基酸；

當所述DNA-肽分子經待測酶作用后，改變氨基端芳香族氨基酸的暴露狀態為(i)時，所述主客體探針由經待測酶作用后的DNA-肽分子與所述葫蘆脲共孵育形成，所述葫蘆脲與經待測酶作用后的DNA-肽分子中的氨基端芳香族氨基酸通過主客體超分子作用連接；

當所述DNA-肽分子經待測酶作用后，改變氨基端芳香族氨基酸的暴露狀態為(ii)時，所述主客體探針由未經待測酶作用的DNA-肽分子與所述葫蘆脲共孵育形成，所述葫蘆脲與DNA-肽分子中的氨基端芳香族氨基酸通過主客體超分子作用連接；

所述DNA-肽分子和葫蘆脲的摩爾比為1:10-250。

7.如權利要求6所述的主客體探針，其特征在于，所述雙鏈DNA分子的長度為20-60bp；

優選地，所述芳香族氨基酸為苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；

優選地，所述經待測酶作用后的DNA-肽分子中的氨基酸數目小于等于20；

優選地，所述葫蘆脲選自下組：葫蘆[6]脲，葫蘆[7]脲，葫蘆[8]脲；

優選地，所述DNA-肽分子和所述葫蘆脲共孵育的反應條件為4℃，反應時間為1-3h。

8.一種系統，包括權利要求1-5任一項所述的分子組合和樣品池，或權利要求6-7任一項所述的主客體探針和樣品池；

所述樣品池包括兩個隔室，兩個隔室被絕緣膜分隔；所述絕緣膜上具有一個直徑為100-150μm的通孔，所述通孔被磷脂雙分子層充滿，在所述磷脂雙分子層中存在一個由α-溶血素蛋白形成的納米孔；樣品池中應用Ag/AgCl電極形成閉合回路。

9.權利要求1-5任一項所述的分子組合物、權利要求6-7任一項所述的主客體探針或權利要求8所述的系統在檢測酶活性濃度中的應用，所述酶為蛋白酶；

優選地，所述酶選自下組：亮氨酸氨肽酶，組織蛋白酶B，基質金屬蛋白酶，羧肽酶M，甲硫氨酸氨肽酶。

10.一種檢測酶活性濃度的方法，包括如下步驟，將待測酶與權利要求1中所述的DNA-肽分子混合，使待測酶對所述DNA-肽分子發生酶促反應，隨后加入所述葫蘆脲進行共孵育，得到待測溶液；將所述待測溶液加入本發明所述的樣品池，通過分析特征電信號實現對酶活性濃度的檢測。